Штамм бактерий соrynевастеriuм insidiоsuм - продуцент полисахарида, стимулирующего образование фактора некроза опухоли и интерлейкина-1

 

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: штамм Corynebacterium Insldlosum выделен из стеблей люцерны. При росте на жидкой синтетической среде, в которой в качестве источника азота используют хлористый аммоний, а углерода - глюкозу, клетки синтезируют полисахарид, обладающий способностью индуцировать образование фактора некроза опухоли и интерлейкина-1 в клетках человека и животных Полисахарид состоит из нейтральных моносахаридов - галактозы и рамнозы, кислая природа обусловлена присутствием пировиноградной кислоты. Полисахарид может быть использаван при лечении опухолевых процессов, а также различных иммунодефицитных состояний. 2 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 N 1/20, С 12 P 19/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ИИМВЗМ

BERT@- ЩУРрщ

БИЬЛИОтекА

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4890833/13 (22) 10.12.90 (46) 23.08.92, Бюл. N 31 (71) Институт микробиологии и вирусологии им, Д.К, Заболотного (72) Л.Д. Варбанец, Р.И. Гвоздяк, В.А. Мурас и О.С. Броварская (56) Tracey К., floury S„Cerami А. Cachectln: а hormone that triggers acute shoch and

Chronic cachexia //. J. Infect. Dis., 1988. 157„ р. 413-420. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ C0RYNE

BACTERIUM INSIDI0SUM — ПРОДУЦЕНТ

ПОЛ ИСАХАРИДА, СТИМУЛИРУЮЩЕГО

ОБРАЗОВАНИЕ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ И ИНТЕРЛЕЙКИНА-1

Изобретение относится к микробиологии, а именно к штаммам микроорганизмов, используемых в микробиологической и медицинской промышленности для получения иммуномодуляторов в часгности полисахаридов, обладающих способностью стимулировать образование фактора нвкроза опухоли (ФНО) и интерлейкина-1 (ИЛ-1) в клетках человека и животных.

Известно использование Mycobacterium

tuberculosis, M. bovis, PropionIbacterfum

acnes в качестве продуцентов липоарабиноманнанов, проявляющих иммунотерапеа-. тическое действие против опухолей.

Выращивание указанных продуцентов проводится на средах, содержащих дорогостоящие реактивы. Культивирование продуцентов проводят в течение длительного периода времени (от 4-х суток до 5-ти недель в зависимости от исследуемой культуры). Выделение Ж „„1756350 А1 (57) Использование: биотехнология, Сущность изобретения: штамм Corynehacterium

insidiosum выделен из стеблей люцерны.

При росте на жидкой синтетической среде, в которой в качестве источника азота используют хлористый аммоний, а углерода— глюкозу, клетки синтезируют полисахарид, обладающий способностью индуцировать образование фактора некроза опухоли и интерлейкина-I в клетках человека и животных Полисахарид состоит из нейтральных моносахаридов — галактозы и рамнозы, кислая природа обусловлена присутствием пировиноградной кислоты, Полисахарид может быть использаван при лечении опухолевых процессов, а также различных иммунодефицитных состояний. 2 ил, липоарабиноманнанов из указанных продуцентов является трудоемким многостадийным процессом, включающим сложную технологию концентрации и очистки препа- Ql рата на молекулярных ситах и аффинных () сорбентах. M. tuberculosis вызывает у чело- () века туберкулез, поэтому является опасным у для работы продуцентом.

В качестве продуцента липополисахарида, проявляющего способность индуцировать образование Ф НО и ИЛ-1, используется Escher!chia coll. Выращивание указанного продуцента проводится на средах, содержащих дорогостоящие реактивы — мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, Выход липополисахарида — 4-5% от сухой массы клеток, Липополисахарид получают экстракцией клеток. Липополисахарид получают экстакцией клеток горячим водным фенолом, Этот реактив явля»res

1756350

10 для че ловека и животных.

В связй с этйм перспективным является использованйе штаммов микроорганизмов, 15 выращибайие которых проводится на дешевых синтетических средах, йолучение пол20 очень токсичным для людей. Наличие липида А в составе липополисахарида обусловливает его токсические свойства, пирогенность. Максимально переносимая доза липополисахарида в опытах на белых мышах 0,125 — 5,00 мгlмг, ЛД so равняется

2 — 3, 5 мг/кг. Кроме того, получаемые воднофенольным методом липополисахариды содержат обычно высокий процент нуклеиновых кислот. Указанные обстоятельства обусловливают невозможность терапевтического примен ния липополисахаридов исахаридов из которых будет более экономичным, безвредным и менее трудоемким и проявляют высокую активность в стимуляции образования ФНО и ИЛ-1, Предлагаемый биополимер иной химической природы, в нем отсутствует липид А, обусловливающий токсичность липополисахаридов. В связи с тем, что полисахариды нетоксичны, они могут быть использованы в качестве терапевтических препаратов.

Предлагаемый ш амм — продуцент полисахарида, являющегося эффективным индуктором образования ряда цитокинов

ФНО и ИЛ-1..

Целью изобретения является получение активного штамма, находящегося в отечественной коллекции, — продуцента полисахарида, проявляющего способность стимулировать образование ФНО и ИЛ-1.

Штамм Corynebacierium 1пз!с11оэие

ИМВ 7246 б, обладающий указанными свойставми, выделен из пораженных стеблей люцерны. Для этой цели часть пораженной ткани на границе с внешне здоровой тканью вырезали скальпелем, промывали в течение 15-20 мин несколькими порциями стерильной воды, Затем растительную ткань растирали в стерильной ступке с небольшим количеством стерильной воды и образующуюся гомогенную кашицу высевали петлей на поверхность агара в чашках

Петри. Чашки помещали в термастат.(температура (25 3) C. Питательными средами для выделения бактерий обычно служат: картофельный агар, картофельный агар +

1 глюкозы, картофельный агар+ 1 дрожжевого экстракта, мясо-пептоннйй агар.

Культуру хранят: на косяках с картофельным агаром при комнатной температуре либо в пробирках на косяках с картофельным агаром, поверхность которого заливаю минеральнйм маслом.

Состав среды картофельный агар: на 1 л дистиллированной воды 200 г картофеля, 0,5g, хлористого натрия, 1,5-2,0% агара, рН 7,0-7,2, Штамм Corynebactertum

tnsidtosum ИМВ 7246 б депонирован в коллекции культур Всесоюзного научноисследовательского института антибиотиков .Минмедмикропрома и имеет регистрационный N 2060.

Штамм С. tnstdlosum ИМВ 7246 б имеет следующие морфологические и биохимические признаки.

Морфологические признаки, Клетки— неспороносные палочки (0,4 — О;6 0,7 — 1,1 мкм), прямые, иногда слабо изогнутые. Располагаются одиночно, парами, могут Y-образно. Грамположительные.

Культуральные признаки, Хорошо растет на обычных питательных средах, На картофельном агаре — колонии круглые, гладкие, приподнятые, блестящие, слабо слизистые, прозрачные, желтого цвета.

На мясо-пептонном агзре — колонии круглые, гладкие, более прозрачные, чем при росте на картофельном агаре. слабо слизистые, желтого цвета, со временем маслообразной консистинции, При росте в мясо-пептонном бульоне— культура растет умеренно, образует нежную пленку и осадок.

Культура растет а азробных условиях, оптимальная темпера-.ура роста 21 — 24 С, vvHvvanbHaa 1 С, максимальная 28-31 С.

Биохимические признаки, Культура не образует кислоту из глюкозы, лактозы, мальтозы, сахарозы,маннита, рамнозы, салицина, Молоко пептонизирует, желатин слабо разжижает, нитраты не редуцирует, не образует индол и сероводород, Используют глюкозу, сахарозу, лактозу, галактозу, глицерин, крахмал, Факторы роста — биотин, никотиновая кислота, гистидин, пуриновые и пиримидиновые основания, Безвредность. Штамм С. insidiosum

ИМВ 7246 б не вирулентен, не токсичен для теплокровных животных. Введение 24-часовой культуры С.1пз1йоыгп ИМ В 7246 б внутрибрюшинно, подкожно и перорально в дозах 5 и 10 млрд микробных клеток на 1 мышь, а также фильтратов среды роста (после культивирования бактерий на жидкой синтетической среде) не вызывало у животных патологического процесса, регистрируемого клинически или при макроскопическом изучении внутренних органов животных.

Штамм ИМВ 7246 б С. insidiosum не патогенен для теплокровных животных, Выращивание бактериальной массы С.

insidiosum ИМВ 7246 б и получение полисахарида иэ него осуществляли следующим образом. Для получения инокулята используют 24-часовую культуру. выращенную на картофельном агаре при (25 + 3)OC. Выращивание продуцента осуществляют в колбах объемом 500 мл, содержащих 200 мл жидкой синтетической среды следующего состава, г/л: MgSOd 0,2; Ка2НРО4 6,0;

КН2РО4 3,0; NH4CI 1,0; глюкоза 5,0. Cioимость 1 л среды дешевле более, чем в 10 раэ.

Иэ выращенной культуры продуцента выделяют целевой продукт мягким щелочным гидролизом клеток.

Пример 1. Культуру С. Insldiosum

ИМВ 7246 б, храняющуюся на косяках с картофельным агаром, засевают на косяк с той же средой и выращивают в термостате при(25 + 3) С втечение 24ч, Затем культуру смывают с косяков жидкой питательной средой описанного состава и засевают в колбы емкостью 500 мл, содержащие 200 мл аналогичной питательной "ðåäû; выращивают в условиях качалок (240 об/мин) в течение 35 ч. Клетки осаждают центрифугированием при 5 СОО об/мин в течение 20-25 мин, промывают физиологическим раствором и подвергают гидролизу в 5 -ном растворе КОН/100 мл на 10 г влажных клеток 8 течение 1,5-2,0 ч. Гидролизат диализуют против водопроводной, а затем дистиллированной воды до нейтрального значения рН, центрифугируют для осаждения неразрушенных клеток, а также загрязняющих компонентов клеточной стенки при 5 000 об/мин в течение 20-25 мин. Полисахарид осаждают из надосадочной жидкости добавлением 5-ти объемов спирта. Осадок освобождают от липидов последовательной обработкой ацетоном, эфиром, а затем смесью хлороформа с метанолом(2:1) и подвергают ионообменной хроматографии на

ДЭАЭ-ТСК гелях. Полисахарид, целевой продукт, злюируют 0,25 М фосфатным буфером, рН 6,0 (фиг.1), Фракции полисахарида собирают, диалиэуют против водопроводной, а затем дистиллированной воды, лиофильно высушивают. В целевом продукте содержится до 80 углеводов.

Моносахаридный состав целевого продукта изучали методом газожидкостной хроматографии (фиг.2) и С-ЯМР-спектро1З скопии. Установлено, что полисахарид состоит из тетрасахаридных повторяющихся звеньв, представленных остатками галактоэы и рамнозы. B качестве кислого компонента присутствует пировиноградная кислота.

Молекулярная масса пплисахарида, установленная гель-фильтрацией на сефарозе

6В. составляет 70 000.

Выход очищенного полисахарида со5 ставляет 10 от сухой массы клеток, Выделенный полисахарид проверяют на способность стимулировать образование

ФНО и ИЛ-1.

Способность полисахарида индуциро10 вать образование ФНО и ИЛ-1 исследовали в культуре стимулированных тиогликолатом мышиных перитонеальных микрофагов (МФ). Перитонеальные МФ собирали путем промывачия брюшной полости мышей ли15 нии DBA средой ВРМИ640, отмывали центрифугированием и вносили в лунки плат (LInbro) в концентрации 1,0 " 10 клеток/мл.

После 2 ч инкубации при 37 С в атмосфере

5 С02 и 95o влажности монослой МФ в

20 каждой лунке тщательно отмывали для удаления неприлипших клеток. Затем в лунки вносили свежую среду с 2 мМ L-глутамина и

80 мкг/мл гентамицина. а также исследуемый полисахарид в соответствующей кон25 центрации.

После 20 ч культивирования надосадочные жидкости культур МФ тестировали на наличие в них ФНО и ИЛ-1, Исследование активности ФНО в супернатантах макрофагальных культур проводили по методу (Fish et al), В качестве клеток-мишеней используют мышиные фибробласты линии 1 929, полученные из коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР. Единицы цитотоксической активности ФНО рассчитывали по уровню 50 -ной цитотоксичности путем использования Loglt-log преобразования и анализа полученных прямых. Стандартная кривая, построена по рекомбинантному ФНО.

ЗО

Содержание ИЛ-1 в исследуемых супернатантах МФ оценивали по их комитогенному эффекту в реакции бластной трансформации (РБТ) мышиных тимоцитов

45 сивность включения метки в культуры лимфоцитов определяли на Р-счетчике.

Спссобность полисахарида С, ins!.lIosum ИМВ 7246 б в концентрации 10 мкг/мл стимулировать образование ФНО и

ИЛ-1 перитонеальными МФ мышей более, чем в два раза превышает способность липополисахарида Escherlchla coll 055:В5, 55 в присутствии субоптимальной дозы (0,5 мкгlмл КонА). Результаты РБТ оценивали по

50 уровню включения Н-тимидина во вновь синтеэируемую ДНК лимфоцитов, Интен1756350

ИЛ-1, имп/мин

25100 + 730

10270 + 1120

Препарат

Штамп

ФНО. е . акт.

5000 + 490

1800 + 170

С. 1пзЫ(озое

ИМВ 7246 б

Е. coll 055:В5

Полисахарид

Липополисаха ид,Я 470 РО

Лбам Фрау ИКВ РЬбб ю д3АЗ TlA.åëå

Фж1 производимого американской фирмой

"Sigma" (таблица).

Таким образом, предлагаемый штамм ИМА 7246 б С. Insldlosum является штаммом, продуцирующим полисахарид. являющийся активным индуктором образования фактора некроза опухоли и интерлейкина-1.

Влияние полисахарида на способность макрофагов стимулировать образование

ФНО и ИЛ-1

Выращивание культуры продуцента более, чем в 10 раз дешевле выращивания

Е. coll.

Полисахарид в отличие от липополисахарида Е, соИ является не токсичным и не обладает побочными действиямн, Изобретение может быть использова5 но в микробиологической промышленности и в медицине, при этом не требуется дополнительных ассигнований для осуществления технологических процессов выращивания продуцента и выделения из

10 него полисахарида.

Формула изобретения

Штамм бактерий Corynebacterium

Insldlosum ВНИИА 2060 — продуцент полисахарида, стимулирующего образование факто15 ра некроза опухоли и интерлейкина - 1. 1756350

Составитель О.Скородумова

Техред ММоргентал Корректор H.róíüêî

Редактор Н.Рогулич

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 3062 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям гщи-ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб„4/8