Способ определения спонтанной агрегации тромбощитов

 

Использование: в медицине, а именно для диагностики и контроля заболеваний, связанных с нарушением функций ферменных элементов крови и их исследования, Цель - повышение точности исследования. Сущность изобретения: по 0,2 мл крови, полученной самотеком в сухую пластиковую пробирку при венепункции, немедленно переносят в три пластиковые пробирки, содержащие соответственно по 1,8 мл 4 -5%-ного буферированного раствора ЭДТА - Na, 4 - 5%-ного буферированного раствора ЭДТА 7 . 1 .-, r Nac 1 %-ным формалином и 0,9%-ного буферированного раствора хлорида натрия с 1 %- ным формалином. Пробы перемешивают и центрифугируют 60 сек. при 95 - ЮОд. В полученных супернатантах определяют количество единичных тромбоцитов, рассчитывают индекс обратимой спонтанной агрегации тромбоцитов (ИОСАТ) по формуа-Ь ле ИОСАТ х 100%, где а - количество тромбоцитов в супернатанте 1-ой пробы; b - количество тромбоцитов в супернатанте 2-ой пробы и при увеличении его свыше 15% определяют внутрисосудистую гиперагрегацию тромбоцитов, индекс активации тромбоцитов (ИАТ) по формуле х100%, где с - количество тромбоци3 тов в супернатанте 3-ей пробы и полученным результатам определяют спонтанную агрегацию тромбоцитов. СП С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (sl)s G 01 N 33/483

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

17092

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4627703/14 (22) 28.12.88 (46) 15.07.92, Бюл,¹26 (71) Алма-Атинский государственный меди цинский институт (72) А.M,Ëèâøèö (53) 615,475 (088.8) (56) Lancet, 1974, ч.2, М 886, рр. 924 — 926. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПОНТАННОЙ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ (57) Использование: в медицине, а именно для диагностики и контроля заболеваний, связанных с нарушением функций ферменных элементов крови и их исследования, Цель — повышение точности исследования.

Сущность изобретения; по 0,2 мл крови, полученной самотеком в сухую пластиковую пробирку при венепункции, немедленно переносят в три пластиковые пробирки, содержащие соответственно по 1,8 мл 4 — 5%-ного буферированного раствора ЭДТА — Na, 4—

5%-ного буферированного раствора ЭДТА—

Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики и контроля заболеваний, связанных с нарушением функций форменйых элементов крови и их исследования, и может быть использовано для диагностики и контроля тромбофилических состояний в гематологической, кардиологической, хирургической практике и других областях медицины.

Цель изобретения — повышение точности исследования, Поставленная цель достигается путем определения количества единичных тромбоцитов в трех пробах крови с 4 — 5%-ным буферированным раствором ЭДТА — Na, 4—

5%-ным буферированным раствором ЭДТА — Na с 1%-ным формалином и 09%-ным

5U 1748067А1

Na с 1%-и ым формалином и 0,9%-ного буферированного раствора хлорида натрия с1%ным формалином. Пробы перемешивают и центрифугируют 60 сек. при 95 — 1009. В полученных супернатантах определяют количество единичных тромбоцитов, рассчитывают индекс обратимой спонтанной агрегации тромбоцитов (ИОСАТ) по формуа — Ь ле ИОСАТ = x 100%, где а — количеа ство тромбоцитов в супернатанте 1-ой пробы; Ь вЂ” количество тромбоцитов в супернатанте 2-ой пробы и при увеличении его свыше 15% определяют внутрисосудистую гиперагрегацию тромбоцитов, индекс активации тромбоцитов (ИАТ) по формуле

b — с а х100%, где с — количество тромбоцитов в супернатанте 3-ей пробы и полученным результатам определяют спонтанную агрегацию тромбоцитов, буферированным раствором хлорида натрия с 1%-ным формалином с помощью автоматического счетчика клеток

"Лаберскель" с последующим сопоставле- нием полученных результатов и расчетом индексов обратимой спонтанной агрегации тромбоцитов, активации тромбоцитов сум марной спонтанной агрегации тромбоцитов.

Способ осуществляют следующим обра-зом, По 0,2 мл крови, полученной самотеком в сухую пластиковую пробйрку при венопункции, немедленно переносят автоматической пипеткой с пластиковым наконечником в три пластиковые пробирки, содержащие соответственно по 1,8 мл, 4 — 5% буфериро1748067 ванного раствора ЭДТА -- Na, 4 — 5 буферированного раствора ЗДТА — Na c 1 -ным формалином и 0,9 буферированного раствора хлорида натрия с 1 -ным формалином (в качестве буфера используется буфер 5

Михаэлиса-веренал-ацетатный, рН готовых растворов 7,4), Пробирки закрывают пластиковыми пробками, пробы аккуратно перемешивают (без встряхивания) и центрифугируют 60 с (при условии, что вре- 10 мя разгона и торможения ротора центрифуги не превышает 60 с) при 95 - 100g (около

1000 об/мин). Из среднего слоя полученных супернатантов берут автоматической пипеткой с пластиковым наконечником 0,02 15 мл и переносят в силиконированный стеклянный стаканчик с 12,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Из приготовленного разведения (1;6300) после перемешивания считают тромбоциты из трех проб 20 последовательно на автоматической системе "Лаборскель" при следующих параметрах: диаметр измерительного капилляра 70 мк., режимы: ID, 70, Iq, М. Устанавливаются пороги дискриминации; верхн и 10 В., ниж- 25 ний 0,4 В (подсчет тромбоцитов может производиться также любым из известных традиционных методов).

Производят вычисление следующих показателей, Индекс обратимой спонтанной 30 агрегации тромбоцитов (ИОСЛТ); ИОСАТ = а — Ь

x100, где а — количество единича ных тромбоцитов из 1 пробы (4 — 5-ный буферирован н ы и раствор ЭДТА — Na), в — 35 количество единичных тромбоцитов из 2 пробы (4 — 5%-ный буферированный рас reop ЗДТА — Na с 1 -ным формалином).

В норме этот показатель 0 — 15, Индекс активации тромбоцитов (ИАТ): ИАТ = 40

Ь вЂ” с — х100%, b — количество единичных тромбоцитов из 2 пробы, с — количество единичных тромбоцидов из 3 пробы (0,9 -ный буферированный раствор хлорида натрия с 45

1 -ным формалином), В норме этот показатель Π— 5%.

Суммарный индекс спонт; нной агрегации тромбоцитов (СИСАТ): CMCAT = а 50 х100 = =ИОСАТ + ИЛТ. В норме этот показатель Π— 20 .

Пример 1. Больная У., 35 лет, история болезни 3567, поступила в реанимационное отделение РКГИОВ 29.10.1988 r. с диагно- 55 зом токсико-аллергический васкулит, осложнивLUèéñя ДВC-ñèípрoìсм. Из вены больной была взята кровь по 0,2 мл в 7 пластиковых пробирок, содержащих по 1,8 мл буферированного раствора с, онцентрацией ЭДТА — Na соответственно: 0,5, 1 0

2,0, 3,0, 4,0, 6,0, 5,.0 в 7 пластиковых пробирок, содержащих rio 1,8 мл буферированного раствора ЭДТА — Na в вышеуказанных концентрациях с 1 -ным формалином и в пластиковую пробирку с 1,8 мл 0,9 -ного буферйрованного раствора хлорида натрия с 1 -ным формалином, Пробы были отцентрифугированы 60с при 100g. Затем на автоматической системе "Лаборсколь" были подсчитаны единичные тромбоциты из среднего слоя полученных супернатантов.

Наибольшее количество единичных тромбоцитов определено в пробах с концентрацией ЭДТА — Na 4 и 5 (210 ": 5x10 /мкл), что свидетельствует о наиболее выраженном анти- и дезагрегационном эффекте препарата в данных концентрациях. В пробах с концентрацией ЭДТА — Na меньше 4% количество единичных тромбоцитов было меньше 210 + 5x10 /мкл и снижалось по мере з снижения концентрации ЭДТА — Na в растворе, что свидетельствует о недостаточном анти- и дезарегационном эффектах препарата в исследованных концентрациях, При увеличении концентрации ЗДТА — Na в растворе до 6% количество единичных тромбоцитов снизилось до 180 + Зх10з/мкл, что связано с повреждающим действием высоких концентраций ЭДТА — Na в растворе на тромбоциты. Аналогичная динамика содержания единичных тромбоцитов наблюдалась и во второй серии проб крови, стабилизированных указанными концентрациями ЭДТА — Na с добавлением I формалина, т.е. самое высокое их содержание определялось в йробах второй серии (ЭДТА — Na c 1%-ным формалином) с концентрацией ЭДТА — Na 4 и 5 / и было достоверно ниже, чем в пробах первой серии (ЭДТА—

Na) с соответствующими концентрациями

ЭДТА — Na без формалина — 110 з

3х10 /мкл. Количество единичных тромбоцитов в пробе, стабилизированной в 0,9%ном буферированном растворе хлорида натрия с 10 -ным формалином, составило

95 +4х10 /мкл, Был произведен расчет индексов, Индекс обратимой спонтанной агрегации тромбоцитов (ИОСАТ) по формуле:

ИОСАТ = x100 % — — - x100 j . а — b 210 — 110

47,6%, что более чем в три раза большс нормы (0 — 15%), Индекс активации тромбоцитов (ИАТ) по формуле; ИАТ = — — - - х100 /, =

b-c

1748067

110 — 95 — х100 = 7,1, что превышает норму почти в 1,5 раза (Π— 5 ).

Суммарный индекс спонтанной агрегации тромбоцитов (СИСАТ) по формуле: СИ-.

САТ = x100 = ИОСАТ + ИАТ = а

=47,6+ 7,1 =- 54,7, что более чем в 2 раза превышает норму (Π— 20 ).

В приведенных формулах а — количество единичных тромбоцитов в супернатанте

1 пробы, в — количество единичных тромбоцитов в супернатанте 2 пробы, с — количество единичных тромбоцитов в супернатанте

3 пробы, Таким образом, у больной был диэгносцирован гиперагрегационный синдром с высоким риском тромботических.осложнений, что послужило основанием для назначения антиагрегантов, При последующем контроле на фоне проводимой антиагрегационной терапии ИОСАТ снизился до

25,3, ИАТ вЂ” до 5,3%, СИСАТ вЂ” до 30,6, При исследовании контрольной группы доноров из 110 человек от 20 до 45 лет были проведены описанные исследования и установлено, что наибольшее количество единичных тромбоцитав определяется в буферированных растворах с 4 — 5%-ной концентрацией ЭДТА — Na в растворах с той же концентрацией ЭДТА — Na с 1 -ным формалином количество единичныхтромбоцитов достоверно меньше, в 0,9 -ном буферированном растворе хлорида натрия с

1 -ным формалином — еще меньше. При проведении сравнительных расчетов были установлены три описанных индекса и определены границы их нормальных показателей: ИОСАТ от 0 до 15, ИАТ вЂ” от 0 до 5%, СИСАТ вЂ” от 0 до 20%.

Пример 2. Больной А„17 лет, история болезни 2987, поступил в гематологическое отделение РКГИОВ 03.09.1988 г, с диагнозом геморрагический васкулит, кожно-суставная форма, Из вены больного была взята кровь по 0,2 мл в 3 пластиковые пробирки с

1,8 мл растворов соотве"ственно: 1 — с 5 ным буферированным раствором ЭДТА — Na

2 — с 5 -ным буферированным раствором

ЭДТА — Na с 1 -ным формалином и 3 — с

0,9%-ным буферировнным раствором хлорида натрия с 1%-ным формалином. Пробы были отцентрифугированы 60 с при 1009.

Затем нэ автоматической системе ")1аборскель" было подсчитано количество единичных тромбоцитов из среднего слоя

5 полученных супренатантов. Определено: в 1 пробе 325х10 /мкл тромбоцитов, во 2 пробе

310х10 /мкл тромбоцитов, в 3 пробе з

260х10 /мкл тромбоцитов. Были рассчитаз дексы: И ОСАТ = 3 х 1 00

325 — 310

=4,6 g, ИАТ = х100% = 15,4о и

СИСАТ =

325 — 260

325 х100% = 20 . Таким

15 образом, ИОСАТ и СИСАТ находились в пределах нормы, а ИАТ, свидетельствующий о высокой потенциальной гиперагрегационной способности тромбоцитов, более чем в три раза превышал норму. Получен20 ные результаты послужили основанием для назначения больному антиагрегационной терапии. При последующем контроле описанным способом на фоне антиагрегационной терапии ИОСАТ и СИСАТ оставались в

25 пределах нормы: 4,5 и 11,4 соответственно, а ИАТ снизился до 6.9 .

Формула изобретения

Способ определения спонтанной агрегации тромбоцитов, включающий взятие

30 пробы крови, внесение ее в две пробирки, добавление в первую пробирку стабилизатора ЭДТА — Na, во вторую — ЭДТА — Na u

1%-ный раствор формалина, центрифугирование с последующим подсчетом в суперна35 танте количества единичных тромбоцитов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа за счет расширения его информативности, дополнительно пробу крови вносят в третью пробирку, 40 куда добавляют 0,9 -ный раствор Naj:I u формалин, в каждую пробирку добавляют буферный раствор для создания рН 7,4, при атом стабилизатор добавляют в виде 4—

5 -ного раствора, затем подсчитывают ко45 личество единичных тромбоцитов в каждой пробирке с последующим расчетом индексов обратимой спонтанной агрегации. активации и суммарной спонтанной агрегации тромбоцитов и по полученным результатам

50 определяют спонтанную агрегацию тромбоцитов.