Способ определения концентрации белка е вируса клещевого энцефалита в препаратах вакцины, сорбированных на гидроокиси алюминия

 

Изобретение относится к иммунохимическим методам измерения содержания антигена в вакцинах против клещевого энцефалита (КЭ). Целью изобретения является повышение чувствительности определения. Количество вирусного антигена определяют иммуноферментным методом (ИФМ) в вакцинах против КЭ, сорбированных на гидроокиси алюминия. Реакцию взаимодействия исследуемого антигена со специфическими антителами проводят при 20-22°С в течение 2-3 ч при постоянном перемешивании в растворе при оптимальной концентрации антител . При этом процесс образования комплексов антиген - антитело происходит в растворе, а не на поверхности панели, тем самым устраняется возможное неблагоприятное механическое воздействие частиц гидроокиси алюминия на подложку антител и на процесс образования иммунных комплексов . С этой же целью для определения в ИФМ количества не связавшихся с антигеном антител их отделяют в составе надосадочной жидкости от частиц гидроокиси алюминия. Концентрацию белка Е в исследуемом препарате вакцины, обратно пропорциональную концентрации не связавшихся с антигеном антител, вычисляют по калибровочной кривой относительно стандартного образца белка Е. Положительный эффект изобретения заключается в повышении чувствительности способа в 40 раз. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

@17082

ГОСУДАРСТВЕН.ЗЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4853180/14 (22) 05,06.90 (46) 07,07.92. Бюл. Рв 25

P1) Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов (72) Я.А.Сальников (53) 615.372 (088.8) (56)-.). of Vlrologlcal Methods., 1989, ч. 25, р.101-108. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА E ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО

ЭНЦЕФАЛИТА В ПРЕПАРАТАХ ВАКЦИНЫ, СОРБИРОВАННЬИ HA ГИДРООКИСИ

АЛЮМИНИЯ (57) Изобретение относится к иммунохимическим методам измерения содержания антигена в вакцинах против «лещевого энцефалита (КЭ). Целью изобретения является повышение чувствительности определения.

Количество вирусного антигена определяют иммуноферментным методом (ИФМ) в вакцинах против КЭ, сорбированных на гидроокиси алюминия. Реакцию взаимодействия

Изобретение относится к области медицинской вирусологип, а именно к изучению способов стандартизации вакцин против клещевого энцефалита (КЭ), сорбированных на гидроокиси алюминия, по количеству измеряемого в них антигена (иммунногенного белка Е).

Целью изобретения является повышение чувствительнос1и определения сорбированного антигена..

Способ осуществляется следующим образом.

В лунках панели для постановки серологических реакций (или инсулиновых флакоЯ2,„, 1746318 А1 (зоз G 01 N ЗЗ/535 исследуемого антигена со специфическими актителами проводят при 20-22 С в течение

2-3 ч при постоянном перемешивании в растворе при оптимальной концентрации антител. При этом процесс образования комплексов антиген — антитело происходит в растворе, а не на поверхности панели, тем самым устраняется возможное неблагоприятное механическое воздействие частиц гидроокиси алюминия на подложку антител и на процесс образования иммунных комплексов. С этой же целью для определения в

ИФМ количества не связавшихся с антигеном антител их отделяют в составе надосадочной жидкости от частиц гидроокиси алюминия. Концентрацию белка Е в исследуемом препарате вакцины, обратно пропорци- а ональную концентрации не связавшихся с антигеном антител, вычисляют по калибровочной кривой относительно стандартного образца белка Е. Положительный эффект изобретения заключается в повышении чувствительности способа в 40 раз. нах, пробирках) готовят трехкратные разведения исследуемого препарата на рабочем буфере (0,01 М фосфатный буфер рН 7,5.

0,13 М хлористый натрий, 10 -ная нормальная лошадиная сыворотка, 0,1 -ный твин

80) в объеме 200-400 мкл. В эти же лунки вносят специфические антитела в объеме

100-200 мкл гого же буфера в разведении, обеспечивающим 50 -ное максимальное связывание исследуемого антигена (оптимальная концентрация), Смесь инкубируют при 20-22 С в течение 2-3 ч при постоянном перемешивании, По окончании инкубации смесь выдерживают

1746318

15-20 мин без перемешивэния для осаждения частиц гидроокиси алюминия (в случае использовэния для инкубэции пробирок или флаконов этот этап можно ускорить центрифугировзнием при 1000 об/мин 3-5 мин). 5

Надосэдочмую прозрачную жидкость, содержащую несвязэвшиеся с исследуемым энтигемом. энтителэ, вносят а панель для

ИФМ с сорбировэнным нэ ней стандартным . энтигеном(подложкой) — белком Е или инэк- 10 тивировэнмым формалином вирусом КЭ.

Формировэние подложки в панели осуществляют путем инкубации стандартного энтигена в концентрации 1-2 мкг/мл в 0.01 M фосфатном буфере рН 7.5 при 4ОС в течение 15

17 ч (в течение ночи), или при 37 С в течение

1-2 ч. Количество связавшихся с подложкой специфических антител выявляют с помощью пероксидазного коньюгзта энтивидовых антител. Количество вирусного 20 энтитела в исследуемом препарате рассчитывают nî калибровочной кривой стандартного раствора антигенэ..

Пример 1. В лунки панели для постановки реакции гемэгглютинэции (пэ- 25 мель 1) вносят по 200 мкл рабочего буфера.

Автоматической пипеткой объемом 100 мкл раститровывают в лунках исследуемый препзрэт инактивировэнной культурэльной вакцины против КЭ, сорбировзнный нэ гид- 30 роокиси алюминия. В лунки с раститровэнным образцом вносят в обьеме 100 мкл рабочего буфера кроличьи антитела к белку

Е в оптимальной концентрации, Панель укрепляют на вибрзторе, устанавливают ре- 35 жим вибрации, не допуская выплескивания смеси из лунок, инкубируют при 20 С в те.чение 2 ч. В панель для ИФМ (пзнель 2) вносят по t00 мкл белка Е в 0,01 М фосфэтном буфере рН 7,5 в концентрации 1 мкг/мл 40 и инкубируют при 37 С 1-2 ч. Панель 1 снимают с вибрэторэ, выдерживают 15 мим до осаждения гидроокиси алюминия. Панель 2 трижды отмывают отмывочным раствором (0,01 М фосфатный буфер рН 7,5, 0,13 М 45 хлористый натрий; 0,05$-ный твин 80).

По 100 мкл надосадочной прозрачной жидкости, не взмучивая осадка гидроокиси алюминия иэ панели 1 перемосят в лунки пэмели 2, инкубирует 1 ч при 37ОС, По 50 окончании инкубэции панель 2 отмывают, как. указано, в лунки вносят по 100 мкл пероксидззного конъюгатз энтикроличьих антител в избыточной концентрации. Имку. бируют 30 мим при 37 С. Панель трижды 55 отмывэют отмывочным раствором, затем однократно 0.01 М.фосфатным буфером рН 7,5 без детергентэ.Вносят в лунки по 100 мкл рэстворэ субстрата (4 мг ортофенилендиэмина в 10 мл ацетатного буфера рН 5,5 с 0,03ф -ным Н20 ). Реэкцию останавливают через 20 мин добавлением в лунки по

50 мкл 5ф-ной серной кислоты. Измерение оптической плотности проводят при

492 нм.

В предлагаемом способе сорбированный нэ гидроокиси алюминия антигем и специфические .антитела взаимодействуют один с другим в рэстворе.во взвешенном состоянии и, таким образом. частицы гидроокиси алюминия не оказывают неблагоприятное мехэническое воздействие ма процесс образования иммунных комплексов, что происходит в известном способе, когдэ антитела фиксированы на поверхности панели. С этой же целью устранения механического воздействия частиц гидроокиси злюминия нз подложку стандартного антигенэ при измерении иммуноферментным методом количества не связавшихся с исследуемым энтигеном антител последние предварительно отделяют от. частиц гидроокиси алюминия и сорбировэнных нз этих частицах иммунных комплексов. В реэультэте предлагаемый способ позволяет в 40 раэ повысить чувствительность определения антигенз в сорбированных вакцинах по срэвнению с известным способом и с одинаковой эффективностью определять энтиген в вакцинах кэк до, так и после сорбирования их нэ гидроокиси алюминия.

Формула изобретения

Способ определения .концентрации белка Е вируса клещевого энцефалита в пре- . паратах вакцины, сорбировэнных на гидроокиси элюминия, включающий инкубэцию сорбировзнного нз гидроокиси алюминия вирусного знтигенэ со специфическими энтителами при постоянном перемешивании с последующим измерением количества не связавшихся с антигеном антител иммуноферментнымметодом, отл ичà lo щийс я тем, что, с целью повышения чувствительно-. сти.способа, реакцию взаимодействия исследуемого антигенз со специфическими антителами осуществляют в растворе при концентрации специфических антител, обеспечивающей 50$ мэксимзльное связывание энтигенэ. далее не связавшиеся с антигемом антителз отделяют в состэве мэдосздочной жидкости от частиц гидроокиси элюминия с последующим определением их концентрэции.