Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l - продуцент моноклонального антитела к щелочной фосфатазе тюленя

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для выявления антигена щелочной фосфатазы тюленя, в медицинской и ветеринарной практике и научно-исследовательской работе , а также для выявления чистого фермента с помощью иммуносорбента. Цель изобретения - получение гибридомного штамма, продуцирующего моноклональное мышиное антитело к щелочной фосфатазе тюленя. Путем слияния миеломы мыши Sp 2/0 с клетками селезенки мыши линии BALB/C, иммунизированной щелочной фосфатазой, выделенной из тонкого кишечника тюленя, получен штамм гибридных клеток, продуцирующих моноклональное антитело к щелочной фосфатазе тюленя в количестве 20-40 мкг/мл культу рал ьного супернатанта, при выращивании в виде асцита - 5- 10 мг/мл. МонАТ принадлежит субклассу Ig61. Штамм гибридомы депонирован под IXh BCKK(II) 377 (Д). 3 табл. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 Р 21/08

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4791832/13 (22) 26.12,89 (46) 30.06.92, Бюл. ¹ 24 (71) Всесоюзный онкологический научный центр AMH СССР и Научно-исследовательская лаборатория биологически активных веществ гидробионтов (72) И,Ю,Сахаров, Е.Б.Мечетнер и И,Е.Степанова (53) 578,085.23 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 13956668, кл, С 12 5/00, 1986. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕMblX КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ МОS

MUSCULUS L-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА К ЩЕЛОЧНОЙ

ФОСФАТАЗЕ ТЮЛЕНЯ (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления антигена — щелочной фосфатазы тюленя; в медицинской и ветеринарной практике и научно-исследовательской деятельности, а также для выделения чистого фермента с помощью иммуносорбента..

Наиболее близким предлагаемому штамму АРР,1 является штамм гибридных культивируемых клеток мыши МАМ-2108 (хранится в коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК 63Д.

Цель изобретения — получение гибридомного штамма, продуцирующего моноклональное мышиное антитело к щелочной фосфатазе тюленя (ШФТ). „„5U „„1 7441 1 2 А1 выявления антигена щелочной фосфатазы тюленя, в медицинской и ветеринарной практике и научно-исследовательской работе, а также для выявления чистого фермента с помощью иммуносорбента. Цель изобретения — получение гибридомного штамма. продуцирующего моноклональное мышиное антитело к щелочной фосфатазе тюленя, Путем слияния миеломы мыши Sp 2/О с клетками селезенки мыши линии BALB/С, иммунизированной щелочной фосфатазой, выделенной из тонкого кишечника тюленя, получен штамм гибридных клеток, продуцирующих моноклональное антитело к щелочной фосфатазе тюленя в количестве

20 — 40 мкг/мл культурального супернатанта, при выращивании в виде асцита — 510 мг/мл. МонАТ прийадлежит субклассу

Ig61. Штамм гибридомы депонирован под

¹ ВСКК(! 1) 377 (Д). 3 табл.

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Криоконсервирование. Для длительного хранения гибридомные клетки замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с. добавлением 10 диметилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание ампул проводят в коробке из вспененного полистирола с толщиной стенок 1 см. Коробку с ампулами составляют при -70 С и через

1 сут переносят ампулы в жидкий азот для хранения. Размораживают клетки, перенося ампулу из жидкого азота в водяную. баню на 37 С.

Культуральные свойства. Среда для культивирования — среда RPMI-1640 с добавлением 10 — 15ф, телячьей эмбриональ1744112 ной сыворотки, 4 мМ 1=глютамина, 10 мМ пирувата натрия, 40 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл стрептомицина при 37 С в атмосфере 57-ной углекислоты. Посевная доза — 10 клеток в 1 мл, Через 3 — 4 дня

5 концентрация антитела в культуральной жидкости достигает 20 — 40 мкгlмл. Контаминация бактериями, грибками и микоплазмой не обнаружена.

Кариологичвская характеристика. Модальное число хромосом — 81, 1. Маркерная метацетрическая хромосома.

Для выращивания гибридомы в асцитной форме клетки вводят в брюшную полость мышей BALB/С, обработанных пристаном, в количестве 2-5х10 клеток на

6 мышь. Опухоли развиваются у мышей через

10-15 дней, Характеристика целевого продукта. Моноклональное антитело, продуцируемое штаммом, относится к 9 подклассу и связывает щелочную фосфатазу тюленя, не затрагивая его активный центр, Продуктивность. Концентрация моноклональных антител в культуральных супернатантах — 20 — 40. мкг/мл, в асцитной жидкости мышей BALB/Ñ вЂ” 5 — 10 мг/мл, Полученный штамм назван APP.1.

Штамм депонирован в коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером

8CKK 377Д.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1, Мышей линии BALB/C иммунизируют внутрибрюшинным введением 50 мкг препарата щелочной фосфатазы, выделенного из тонкого кишечника тюленя, в 0,2 мл забуференного фосфатэми физраствора (ЗФР), содержащем 30, . полного адьювантэ Фрейнда. Через 4, 28 и 42 дня иммунизацию повторяют введением внутрибрюшинно 50 мкг антигена в ЗФР без адьюванта. Через 4 дня послеэтого 10

8 клеток селезенки иммунных мышей гибридизовали с 15х10 клеток миеломы мыши Sp

2/0 в присутствии 0,7 мл раствора, содержащего 50% (обьем/обьем) полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол.массы 1500 в течение 1 мин.

После гибридизации и отмывки клеток от

ПЭГа клетки высевают в 96-луночные панели по 2х10 клеток в лунку. Для культивиро5 вания и селекции гибридов используют срЕду RPVI-1640 с добавлением 10",Ь телячьей эмбриональной сыворотки. 10 M гипоксантина, 4х10 М эминоптерина и

-7

1,6х10 M тимидина. Гибриды-продуценты клонируют 3 раза методом конечных разведений, высевая по 1 клетке в лунку, содержащую 4х10 клеток макрофагов. После

5

2 клонирования 100 субклонов продуцируют антитела к щелочной фосфатазе тюленя. Продукция антитела сохраняется как минимум в течение 10 пассажей в культуре.

Гибридомные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см по 5х10 в 5 мл среды RPVI-1640 с 10 эмбриональной телячьей сывороткой, 4 мМ глютамина, 10 мМ пирувата натрия, 40 мкг/мл гентамицина и культивируют 4 дня при 37 С в атмосфере, содержащей 5 g> СО2. Для получения асцитной опухоли 5х10 гибридомных клеток вводят в брюшную полость мышей

BALB/Ñ, обработанных пристаном. Через

2 — 3 недели собирают асцитную жидкость и иммуноглобулины осаждают сульфатом натрия. Осадок растворят в 0,2 M боратном буфере (рН 8,1) с 0,15 М NaCI и диализуют против того же буфера.

Культуральную жидкость, содержащую антитела, используют как реагент для изучения специфичности взаимодействия антитела с щелочной фосфатазой тюленя. Для этого на полистироловый 96 ячеечный планшет для микротитрования сорбируют ШФТ1 мкг на ячейку в 100 мкл карбонатного буфера {100 мМ, рН 9,6) при 4 С в течение ночи (Elisa метод), После насыщения планшета 0,2%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) для уменьшения неспецифического связывания антител пластиком, в ячейки планшета вносят 100 мкл культуральной жидкости штаппа в различных разведениях (1 ч, 370C) (табл;1). Планшет отмывают 4 раза по 100 мкл ЗФР с 0,2%

БСА и 0,057 Твин-20 и вносят коньюгат антител кролика против иммуноглобулинов мыши, ковалентно связанных с пероксидазой {2 мкг/мл, 370С, 1 ч), После окончания инкубации несвязавшиеся продукты реакции отмывают указанным способом, а связующуюся пероксидазу определяют количественно по расщеплению субстрата (Hz0z) в присутствии хромогена — ортофенилендиамина. Положительная реакция проявляется при 490 нм..

Результаты опыта по изучению специфичности связывания иммуноглобулинов штамма с щелочной фосфатазой тюленя, сорбированной на пластике, представлены в табл, 1. Данные представлены как среднее и ошибка среднего. н-3.

Результаты этого примера свидетельствуют о высокой специфичности моноклонального антитела, вырабатываемого клетками штамма APP.1 и показывают возможность применения этого моноклонального антитела для выявления иммобилизованной щелочной фосфатазы тюленя с

1744112

;Таблица 1

Культурная среда

Оптическая плотность и и490нм

Разведение

Штамм APP.1

0,86+0,03

0,25+0,03

0,16+0,02

0.09+0,02

0,07+0,01

25 125

625

125

0,07+0,02 помощью твердофазного иммуноферментного метода.

Специфичность взаимодействия МкАТ с щелочной фосфатазой тюленя в растворе исследована также с помощью метода "обогащения", На полистироловый 96-ячеечный планшет для микротитрования сорбируют антитела кролика против иммуноглобулинов мыши: 200 мкл на ячейку в концентрации 10 мкг/мл (4 С, ночь), затем сорбируют иммуноглобулины мыши из культуральной жидкости штамма ААР.1 в различных разведениях (1 ч, 37 С). После отмывки панели

0,05 -ным раствором Твина-20 от несвязавшихся иммуноглобулинов, в ячейки вносят раствор ШФТ (200 мкл, концентрация фермента 10 ед/мл). ШФТ, связующуюся с моноклональным антителом, определяют количественно в ячейках для микротитрования спектрофотометрически по расщеплению и-нитрофенилфосфата при 405 нм, Результаты опыта по изучению специфичности взаимодействия МкАТ, вырабатываемых клетками штамма AAP.1 с ШФТ в растворе, показаны на табл, 2. Данные представлены как среднее и ошибка среднего, н-3.

Результаты этого примера свидетельствуют о высокой специфичности моноклонального антитела, вырабатываемого клетками штамма AAP.1, по отношению к

ШФТ и показывают возможности примене. ния этого моноклонального антитела для выявления активности ШФТ в растворах.

Пример 2. Отличие моноклональных антител APP.1 и МАМ-2108.

Известно, что антитула МАМ-2108 взаимодействуют исключительно с ШФ телеШтамм А — АСЕ-9В9, вырабатывающий МкАТ против ангиотензинпревращающего фермента (отрицательный контроль 1)

0,2 раств-р бСА в ЗФР (оти ательный контроль 2) . нка и не связываются с ферментом тюленя, Аналогичное исследование проведено для антител APP.1. Для этого на полистироловый 96-ячеечный планшет для микротитро5 вания сорбируют антитела кролика против иммуноглобулинов мыши: 200 мкл на ячейку в концентрации 10 мкг/мл(4 С, ночь), затем сорбируют иммуноглобулины мыши из культуральной жидкости штамма AAP.1 в раз10 личных разведениях (1 ч, 37 С). После отмывки панели 0,05 -ным раствором Твийа-20 с несвязавшихся иммуноглобулинов в ячейки вносят раствор ШФ тюленя или теленка (200 мкл, концентрация фермента

15 10 ед/мл). ШФ, связавшуюся с моноклональным антителом, определяют количественно в ячейках для микротитрования сиектрофотометрически по расщеплению инитрофенилфосфата при 405 нм. Результа20 ты эксперимента показаны на табл. 3.

Данные представлены как среднее и ошибка среднего, н-3.

Результаты этого примера свидетельствуют о том. что антитела APP.1, как и анти25 тела MAM — 2108, различают ШФ тюленя и теленка.

Однако, обнаруживаемое отличие в случае АРР,1 имеет совершенно другой характер, нежели в случае МАМ-2108, что

30 позволяет утверждать, что антитела АРР,1 и

MAM-2108 обладают различной эпитопной специфичностью, Формула изобретения

35 Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L(BCKK(ll) 377 (Д)-продуцент моноклонального антитела к щелочной фосфатазе тюленя.

1744112

Таблица 2

Таблица 3

Составитель И.Тареева

Редактор М.Недолуженко Техред M.Ìîðãåíòàë . Корректор М.Пожо

Заказ 2169 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101