Питательная среда для культивирования francisella тulаrеn sis
Использование: микробиология, диагностика туляремии, получение биомассы бактерий. Francisella tularensis. Сущность изобретения заключается в том, что питательная среда состоит из следующих компонентов: забуференный гидролизат рыбной кормовой муки, ферментолизат черного альбумина , дрожжевой экстракт или смесь витаминов группы В, сернокислый магний, сернокислый натрий, цистеин, глюкоза, агар и дистиллированная вода. Культуры F.tularensis, выращенные на этой среде, типичные по культурально-мбрфологическим свойствам. Среда позволяет упростить и повысить эффективность бактериологических исследований при диагностике туляремии, увеличить выход биомассы при производстве тулляремийных диагностикумов, 1 табл. сл С
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (5!)5 С 12 N 1/20
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ пО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ (21) 4863012/13 (22) 27.06,90 (46) 30.04.92. Бюл. N" 16 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) Л,B.Ëîãà÷åâa, T.Ï.Ìîðoçîâà, В.А.Кундин, И.Ю,Дмитриева и В.И.Артюхин (53) 576.8.093.31(088.8) (56) Appl. microbiol. v,10. 1962, N 1, р.90-92, Appl. microbiol„v.14, 1962, ¹ 5 р.407-.
412.
Appl. microbiol. March. 1965.
Микробиология и иммунология 0 0 И, 1964, с.251 — 153, Авторское свидетельство СССР
N . 1614494, кл, С 12 N 1/20, 1989.
Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1969. ¹ 4, с.34-36.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для накопления биомассы и при диагностике туляремии, Цель изобретения — повышение ростовых свойств среды и выхода биомассы.
Поставленная цель достигается тем, что среда, содержащая питательную основу, стимуляторы роста, цистеин, глюкозу, агар и дистиллированную воду. дополнительно содержит сернокислый магний и сернистокислый натрий, в качестве питательной основы она содержит забуференный гидролизат рыбной кормовой муки, рН 6.9-7.2; а в качестве стимуляторов роста — ферментолизат черного альбумина и дрожжевой экстракт или смесь витаминов группы В при следующем соотношении компонентов г/л:
„,!Ж„„1730143 А 1 (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ FRANCISELLA TULARENSIS (57) Использование: микробиология, диагностика туляремии, получение биомассы бактерий Franciseila tularensis. Сущность изобретения заключается в том, что питательная среда состоит из следующих компонентов: забуференный гидролизат рыбной кормовой муки, ферментолизат черного альбумина. дрожжевой экстракт или смесь витаминов группы В, сернокислый магний, сернокислый натрий. цистеин, глюкоза, агар и дистиллированная вода. Культуры
Р tularensis, выращенные на этой среде, типичные по культурально-мОрфологическим свойствам. Среда позволяет упростить и повысить эффективность бактериологических исследований при диагностике туляремии, увеличить выход биомассы при производстве тулляремийных диагностикумов, 1 табл. е
Забуференный гидролизат рыбной кормовой муки, рН 6,9 — 7,2 16,0-18,0
Ферментолизат черного альбумина 4,0-6,0
Дрожжевой экстракт или1,5 — 2,5 смесь витаминов группыВ 0,014 — 0,018
Сернокислый магний 0,45 — 0,55
Сернистокислый натрий 0,65 — 0,75
Цистеин 0,4-0,6
Глюкоза 2,0 — 11,0
Агар 10,0-12,0
Дистиллированная вода До 1 л причем смесь витаминов содержит тиамин и пантотенат кальция в равных количествах, Пример 1, Приготовления среды производится следующим образом.
1730143
1, Получение гидролизата PC.
Сернокислотный гидролиз рыбной кормовой муки проводят при температуре
131 + 2 С в течение 2 ч, Далее последовательно проводят следующие операции, первичная фильтрация, деионизация, осветление, вторичная фильтрация. В обработанный по этой схеме гидролизат для создания необходимой буферности и осмомолярности вводят минеральные соли: одно- и двузамещенные фосфаты калия, хлористый натрий, Гидролизат прогревают, фильтруют, устанавливают значение рН 7,2 и 2,0 и сушат в распылительной сушилке.
2. Получение стимулятора роста (СР ГМ), Ферментолиз черного альбумина проводят протосубтилином Г 10 Х, Г 3 Х при температуре 50 +.2 С в течение 40 мин.
Затем реакционную смесь прогревают при
120 С + 2 С в течение 30 мин, охлаждают до 60 — 70 С, фильтруют и сушат на распылительной сушилке.
3, Для определения оптимальных концентраций ингредиентов готовят питательную среду следующего компонентного состава, г/л:
Гидролизат PC 16,0
СРГМ 2.0
Цистеин 0,4
Дрожжевой экстракт 1.5
Смесь витаминов 0,014
Глюкоза 2.0
Mg SO4 7Н20 0.45
МагЯОз 0.65
Агар 10,0
Дистиллированная вода До 1 л растворяют в дистиллированной воде и кипятят 10 — 15мин, не допуская пригорания.
Среды охлаждают до 45 — 50 С и вводят факторы селективности. мг/л:
Кефзол 10 или цефалексин 20
Амфотеррицин 10
Амфогл юкамин 40
Ристомицин 40
Факторы селективности вводят во Все среды, стерилизуемые кипячением, а также в случае приготовления селективных вариантов. При стерилизации автоклавированием среда нагревается до расплавления агара и стерилизуется при 110 С в течение
30 мин.
Пример 2. Среду готовят аналогично примеру 1 при следующем соотношении ингредиентов, г/л;
Гидролизат PC 18,0
СРГМ 6,0
Цистеин 0,6
ДЭ или 2,5 смесь витаминов 0,018
Глюкоза 11,0
MgS04 7НгО 0,55
5 Наг ЯОз 0,75
Агар 12,0
Дистиллированная вода До1л
Пример 3, Среду готовят аналогично примеру 1 при следующем соотношении
10 компонентов, г/л:
Гидролизат PC 17,0
СРГМ 5,0
Цистеин 0,5
ДЭ или 2,0
15 смесь витаминов 0,016
Глюкоза 5,0
MgSO4 7Н20 0,5
Ма2$0з 0,7
Агар 11,0
20 Дистиллированная вода До 1л
Для удобства применения, транспортирования, а также с целью стандартизации среды разработан вариант сухой питательной среды предлагаемого состава, 25 П р и м е. р 4, Для получения 1 кг сухой питательной среды необходимо смешать в смесителе барабанного типа ингредиенты среды в количестве, r:
Гидролизат PC 383,0
30 СРГМ 106,5
ДЭ или 42,6 смесь витаминов 0,340
Цистеин 10,7
Глюкоза 213,0
MgS04 7Н20 10,7
NazSOa 14,9
Агар 234,3
Сухую среду расфасовывают в соответствующую тару, герметично упаковывают и
40 хранят в сухом месте при температуре не выше 35 С.
Для приготовления 1 л питательной среды, необходимо 47 г порошка тщательно размешать в 1000 мл дистиллированной воды, 45 простерилизовать по примеру 1 и разлить в чашки Петри, пробирки, матрацы.
Пример 5. Экспериментальная проверка ростовых свойств среды.
В качестве тест-штаммов используют
50 вакцинный штамм N 15 НИИЭГ и вирулентный N 503 Р tularensis. В качестве среды сравнения (контроля) используют известную среду. Проверку ростовых свойств среды проводят, определяя следующие
55 показатели: чувствительность среды (минимальна посевная доза, вызывающая рост тест-штаммов); показатель прорастания (процентное отношение числа колоний, сформировавшихся на испытуемой среде, к
1730143
1,5 — 2,5
50 числу таковых на контроле); скорость роста (время появления типичных колоний): продуктивность среды (выход биомассы с 1 мл среды).
Для определeHèÿ эти показателей испол зуют инокуляты из 2-суточных культур тест-штаммов, выращенных на среде МакКая. Посевной материал, содержащий
5 . 10,50,500м.к,/мл, готовятпостандарту
6 мутности ГИСК на 10 ед. путем десятикратных разведений в физиологическом растворе.
Для определения чувствительности, показатели прорастания, скорости роста взвеси тест-штаммов с концентрацией 50 и
500 м.к./мл высевают на 5 агаровых пластин с вариантами сред N 1.2.3.4 и контролем по 0,1 мл на каждую.
В таблице приведены ростовые свойства питательных сред, полученных согласно примерам.
Из представленных данных видно, что предлагаемая среда для диагностики туляремии отвечает требованиям, предьявляемым к этим средам. Культуры F tularensis, получаемые на этой среде. типичны по культурально-морфологическим свойствам.
Для определения продуктивности среды засевают 5 пробирок со скошенным агаром 0,2 мл взвеси с концентраций
5 10 кл/мл и инкубируют посевы при
37 С в течение 48 ч. О п родукти вности судят по количеству жизнеспособных клеток в полученной биомассе, Из полученных данных следует, что продуктивность предлагаемой среды находится на уровне 35 10 кл/мл, что в 1.5 раза превышает продуктивность известной среды.
Использование среды позволяет при упрощении технологии приготовления повысить эффективность бактериологических исследовании при диагностике турялемии, увеличить выход биомассы при производств туляремийных диагностикумов, а также отказаться or использования крови в пита5 тельных средах. сЬормула изобретения
Питательная среда для культивирования Francisella tularensis. содержащая пита10 тельную основу, стимуляторы роста. цистеин. глюкозу, агар и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения ростовых свойств среды и выхо да биомассы, она дополнительно содержит
15 сернокислый магний и сернистокислый натрий. в качестве питательной основы она содержит эабуференный гидролизаг р :бной кормовой муки, рН 6,9 — 7,2, а в качеств;-. стимуля- oðΠроста - ферментолизат черно20 го aëüáóìèHa и дрожжевой экстракт или смесь oèTaMYiHQB группы B при следуюше 1 соотношении компонентов, г/л:
Забуференный гидролизат рыбной кормовой
25, муки, рН 6,9 — 7,2 16,0 — 18,0 ц-:ерментолизат черного альбумина 4,0-6,0
Дрожжевой экстракт или
30 смесь витаминов груп- . пы В 0,014 — 0,018
Сернокислый магний 0,45-0,55
Сернистокислый натрий 0,65 — 0.75
Цистеин 0.4-0,6
35 Глюкоза 2,0 — 11,0
Агар 10,0-12,0
Дистиллированная. вода До 1 л
2. Питательная среда по п,1, о т л и ч а ющ а я с я тем, что смесь витаминов содержит
40 тиамин и пантотеяат кальция в paBHbix количествах.
1730143 о с о
Y х
5 м
Ю „, S
IX
X
Ф
CD о 5
a <
>5 а 5 о * Э.
Ф а
СЧ и Н, <О
lD,, м Н о и Н 11 о
g -Н -Н Ф . LA
Е
1 о о
-0 с
CD
Ф о
Ф л т
5
Щ
Iо
CD а о а с с
Q)
IЩ
Ф
Я о
IS рС а. CLI Б S а с о с С 3 м сч с-> .Н Н .Н Н Н дe СО С 4 N N М O rr сг м м Н Н Н Н - О ID 4. и ) O СЧ N N O