Способ диагностики ювенильного ревматоидного артрита

 

Изобретение относится к медицине, а именно ревматологии, и может быть использовано для диагностики юванильного ревматоидного артрита. С целью повышения точности диагностики и упрощения способа , основанного на исследовании спонтанной активности лимфоцитов периферической крови ин витро, определяют спонтанную активность лимфоцитов в присутствии преднизолона в концентрации 0,1 мкг/мл культуры, и при увеличении активности по сравнению с исходной диагностируют ювенильный ревматоидный артрит. 3 табл.

СООЭ СОВЕ1СКИХ сОциАлистических

РЕСПУБЛИК (я) и G 01 N 33/74

ГОСУДАРСТ8ЕННЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4752986/14 (22) 23.10.89 (46) 07.04.92. Бюл. М 13 (71) Ленинградский педиатрический медицинский институт и Научно-исследовательскийй институт экспериментальной медицины АМН СССР (72) В.В.Юрьев, П.Г.Назаров, Н.И.Кондакова и В.И.Пуринь (53) 616.07 (088.8) (56) Слизовский. Н.В. Автореферат канд. дисс. — Л., 1988, с. 13. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЮВЕНИЛЬНОГО РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА

Изобретение относится к медицине, а именно к ревматологии, и может быть использовано для диагностики ювенильного ревматоидного артрита.

Целью изобретения является повышение точности диагностики и упрощение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Для оценки влияния преднизолона на спонтанную активность клеток периферической крови используют метод культивирования цельной крови в микроплатах. Для исследования используют культуральную среду, приготовленную из среды 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогато го скота и антибиотиков (пенициллина и стрептомицина по 100 ЕД/мл). На 100 мл этого раствора добавляют 37,-ный глютамин (1 мл); 7,57-ный гидрокарбонат натрия (2,5 мл); 10 6-ный хлористый кальций (0,07 мл) и 407ь-ную глюкозу (0,25 мл). Гепарини50«1725132 Al (57) Изобретение относится к медицине, а именно ревматологии, и может быть использовано для диагностики ювенильного ревматоидного артрита. С целью повышения точности диагностики и упрощения способа, основанного на исследовании спонтанной активности лимфоцитов периферической крови ин витра, определяют спонтанную активность лимфоцитов в присутствии преднизолона в концентрации

0,1 мкг/мл культуры, и при увеличении активности по еравнению с исходной диагностируют ювенильный ревматоидный артрит. 3 табл. зированную венозную кровь(25 — 30ед. гепарина на 1 мл крови) смешивают с 10 -ным желатином в отношении 5:1 и инкубируют при 37 С в течение 30 мин. Лейковзвесь снимают, производят подсчет общего числа лейкоцитов и разводят культуральной средой до концентрации лимфоцитов 130 тыс./мл, 0,15 мл этой суспензии вносят в каждую лунку полистиролового 96-луночного v-образного планшетадля иммунологических реакций, добавляя дополнительно 10 млн. аутологических эритроцитов на лунку.

Для каждого больного ставят по 6 культур, В половину культур вносят преднизолон в концентрации 0,1 мкг/мл культуры. другие три культуры служат контролем без преднизолона. Затем культуры имкубируют при

37 С в атмосфере абсолютной влажности с

5 % СО2 (в С02- инкубаторе "Flow", Великобритания) в течение 72 ч. За сутки до окончания инкубации вносят радиоактивную метку (0,4 мкКи Н-тимидина на лунку), По1725 t32

15

25

35

45

50 сле окончания инкубации культуры снимают с помощью коллектора с осаждением и промывкой клеток на фильтрах. Фильтры с исследуемым клеточным материалом высушивают. помещают в счетные флаконы со сцинтиллятором и просчитывают на сцинтилляционном счетчике "Ракбета" (LKB, Швеция). Сцинтиллятор готовят следующим образом: на 1 л толуола берут 5 г

2,5-дифенилоксазола (ППО) и 100 мг 1,4-ди2-(5-фенилоксазолил)-бензола (ПОПОП).

ПОПОП предварительно смешивают с 100200 мл толуола и в течение 20-30 мин греют на водяной бане под ватно-марлевой пробкой до полного растворения. Компоненты смешивают и сцинтиллятор выдерживают в темноте в течение 1-2 сут, после чего используют, внося по 5 мл на счетный флакон, Оценку функциональной активности лимфоцитов проводят по спонтанному синтезу

ДНК лимфоцитами периферической крови, что учитывают по включению радиоактивной метки Н-тимидина в ДНК лимфоцитов и выражают числом импульсов в минуту.

После получения результатов со счетчика вычисляют среднее значение показателя включения метки для культур без препарата (с ошибкой средней) и границы доверительного интервала для этих показателей спонтанной функциональной активности лимфоцитов периферической крови каждого больного с вероятностью P = 0,95 по ме тоду определения доверительной эоны линейной регрессии. Вычисляют также средний показатель включения метки в

ДНК в присутствии преднизолона также для каждого больного. Этот показатель сравнивают с границами доверительного интервала показателей спонтанной активности лимфоцитов. без преднизолона для анализируемого больного. Если показатели спонтанной активности лимфоцитов в присутствии преднизолона выше верхней границы или ниже нижней границы вычисленного доверитЕльного интервала, то говорят о достоверном изменечии функциональной активности лимфоцитов под влиянием преднизолона. Если показатель спонтанной активности лимфоцитов в присутствии предниэолона находится в пределах доверительного интервала, то преднизолон не оказывает достоверного влияния на спонтанную активность лимфоцитов. В этом случае говорят об отсутствии влияния преднизолона на спонтанный синтез ДНК или об отсутствии чувствительности клеток периферической крови к преднизолону.

Пример 1, Больная Коржаева E., 1983

r. рождения, поступила в кардиоревматологическое отделение 02.12.87 г, Из анамнеза известно, что девочка заболела 1,5 года назад, когда после травмы появилась. болезненность при ходьбе и отечность левого голеностопного сустава. Лечилась амбулаторно нестероидными противовоспалительными средствами. На протяжении заболевания отметили присоединение пястно-фалангового сустава 2-ro пальца правой руки. При поступлении суставы дефигурированы, отмечалось ограничение подвижности. При отфальмологическом обследовании выявлен правосторонний увеит.

Было проведено обследование по предлагаемому способу сразу при поступлении в стационар. Для исследования использовали культуральную среду, приготовленную из среды 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков (пенициллина и стрептомицина по 100 ЕД/мл).

На 100 мл этого раствора добавляли 3%-ный глютамин (1 мл); 7,5%-ный гидрокарбонат натрия (2,5 мл); 10%-ный хлористый кальций (0,07 мл); 40%-ную глюкозу (0,25 мл). Гепаринизированную(25 — 30Ьд.гепарина на 1 мл крови) венозную кровь смешивали с 10%ным желатином в отношении 5:1 и инкуби- ровали при 37 С в течение 30 мин.

Лейковзвесь снимали, производили подсчет общего числа лейкоцитов и лимфоцитов и разводили культуральной средой до концентрации лимфоцитов 130 тыс/мл. 0,15 мл этой суспензии вносили в каждую лунку полистиролового 96-луночного ч-образного планшета для иммунологических реакций, добавляя дополнительно 10 млн аутологичных эритроцитов на .лунку. Для каждого больного ставили по 6 культур. В половину культур вносили преднизолон в концентрации О, l мкг/мл культуры, другие три культуры служили контролем без преднизолона.

Затем культуры инкубировали при 37 С в атмосфере абсолютной влажности с 5% С02 в течение 72 ч. За сутки до окончания инкубации вносили радиоактивную метку (0,4 мкКи Н-тимидина на лунку). После окончания. инкубации культуры снимали с помощью коллектора с осаждением и промывкой культур клеток на фильтрах.

Фильтры с исследуемым клеточным материалом высушивали, помещали в счетные флаконы.со сцинтиллятором и просчитывали на сцинтилляционном счетчике. Использовали сцинтиллятор следующего состава: на 1 л толуола 5 г flflO и 100 мг.ПОПОП. На счетный флакон вносили по 5 мл сцинтиллятора.

Оценку функциональной активности лимфоцитов проводили Ilo спонтанному синтезу

ДНК лимфоцитами периферической крови, что учитывали по включению радиоактивной

1725132 метки в ДНК лимфоцитов и выражали чис- При получении результатов со счетчика лом импульсов в минуту. вычисляли средний показатель включения

Послеполученияреэультатовсосчетчи- радиоактивной метки в ДНК лимфоцитов ка вычисляли среднее значение показателя контрольной группы детей (10 человек), ковключения метки для культур без препарата 5 торый составил 318+38 имп /мин. О значии границы доверительного интервала для тельном достоверном .повышении этих показателей с вероятностью Р=0,95 по спонтанного синтеза-ДНК у больного говометоду определения доверительной зоны рили при средних показателях, превышаюлинейной регрессии. Вычисляли также щих M +1,56 группы здоровых детей (т.е. средний показатель включения метки в ДНК. 10 489 имп/мин). Получены результаты: среда присутствии предниэолона. Получили ре- ний показатель спонтанной активности зультаты, спонтанный синтез ДНК лимфа- лимфоцитов больной составил 407 цитами в культурах без преднизолона 577 имп/мин, что не выше вычисленного предеимп/мин. при доверительном интервале ла М - 1,56 (489 имп/мин) здоровых детей.

514-640 имп/мин. Спонтанный синтез ДНК 15 Полученные данные отрицают диагноз в культурах с преднизоланом 245 имп/мин. ЮРА.

llo данным обследования выявлено досто- Контрольное комплексное обследоваверное изменение (ингибиция) спонтанной ние, проведенное еучетом клинико-лабораактивности лимфоцитов под влиянием торных, .рентгенологических данных на преднизолона, на основании чего выстав- 20 основе критериев диагностики ЮРА,позволендиагноз; ювенильный ревматоидныйар-- лило поставить диагноз ЮРА. трит (ЮРА). Такимобразом, выявленосовпадениедиПроведено обследование по известно- агноза,.поставленного предлагаемым спосому способу. В гепаринизированной - крови - бом, и несовпадение диагноза по известному производили подсчет общего числа лейко- 25 способу с контрольным диагнозом. цитов и лимфоцитов. В культуру(общий обь- Пример 2. Больная Диденко И., 1974 ем 3 мл) вносили 5 х 1.0 лимфоцитов, что г. рождения. Поступила:i кардиоревматолосоставило 0,2 мл цельной крови. Культу- гическое отделение 23;10.87 r.. с жалобами рал.ьная среда состояла иэ среды 199 с 10 на болезненность при движении в лучезапясыворотки крупного рогатого скота и анти- 30 стных суставах обеих рук. Из анамнеза избиотиков (пенициллина и стрептомицина по BGGTHQ, что девочка заболела 10 дней назад, 100 ЕД/мл культуральной среды}. Смесь ин- когда через 20 дней после ожога появилась кубировали при 37 С в течение 24 ч. За 5 ч отечность и болезненность правого лучезадо окончания опыта в культуры вносили по пястного сустава, затем присоединился вто2 мкКи Н-тимидина в обьеме 0,1 мл. На 35 ройлучезапястныйсустав.При поступлении следующий день во флаконы добавляли 3 - внешне суставы не изменены, местно — поную уксусную кислоту (УК) для лиэиса зрйт- - вышение температуры. Лабораторная ак роцитов, содержимое флаконов переносили тивность невысокая (СОЗ 15 мм/ч, СРБ 1+), в центрифужные пробирки, флаконы про- рентгенологически изменений со стороны сумывали З -ной УК и смыв добавляли в цен- 40 ставов не выявлено. За время нахождения в трифужные пробирки. Осажденные клетки стационаре(1,5месяца)получалалечениенересуспендировали снова в 3%-ной УК и цен- стероидными противовоспалительными претрифугировали. После второго центрифуги- паратами, проведен курс антибактериальной рования к осадку добавляли 5. мл холодной терапии с положительным эффектом.

5 -ной трихлоруксусной кислоты (ГХУ), и 45 Было проведено обследование по предпробирки выдерживали при 4 С в-течение лагаемому способу Согласно. примеру 1.

30 мин до полного выделения из клеток кис- Получены результаты:. спонтанная активлоторастворимыхфракций.Послезтогаоса- . ность лимфоцитов больной 242 имп/мин док дважды отмывали 5 -ной ТХУ. при доверительном интервале от 193-291

Кислотонераствримые фракции осаждали 50 имп/мин с точностью Р =. 0,95. Показатель на нитроцеллюлозных мембранных фильт- спонтанной активности лимфоцитов в прирах. Высушенные фильтры с фиксирован- сутствии преднизолона 204 имп/мин, т.е. не ным на них материалом помещали на дно. выходит за пределы вычисленного доверифлаконов для сцинтилляционного счетчика тельного интервала, Полученные результаи заливали 5 мл сцинтилляционной жидко- 55 ты отрицают диагноз ЮРА. сти следующего состава; 4 г ППО и 0,05 г Проведено обследование согласно изПОПОП на 1л толуола. Пробы просчитывали вестному способу аналогично примеру 1. на жидкостномсцинтилляционном счетчике Получены результаты: показатель спонтани результаты выражали числом импульсов ного синтеза за ДНК в лимфоцитах больной за 1 мин.

1725132

Таблица 1

495 имп /мин.т.е. по сравнению с вычисленным пределом М й1,56 здоровых детей(489 . имп/мин) показатель повышен,.что предполагает диагноз ЮРА.

Комплексное контрольное обследова- 5 ние при выписке позволило поставить девочке диагноз: реактивный артрит (послеожоговый). т,е; диагноз IOPA был отвергнут.

Таким образом, данный пример демон- 10 стрирует повышение точности диагностики предлагаемым способом по сравнению с известным, так как отмечалось совпадение диагноза по предлагаемому способу с контролем. Диагноз, поставленный соглас- 15 но известному.способу, не совпал с контрольным.

Пример 3. Больной Уразгалиев А., -,1975 г. рождения, поступил 08.01.88 r. Заболел 2,5 месяца назад, когда через 2 недели 20 после перенесенной ОРВИ появилась отеч- . ность и болезненность правого коленного сустава. Сустав дефигурирован, болезненный при пальпации, утренняя скованность длится 15 мин. Лабораторная активность 25 высокая (СОЭ 42 мм/ч, СРБ 3+), выявлен РФ в сыворотке в титре 1:128 реакцией ВаалерРозе. Рентгенологические изменения в суставе соответствуют I ct. по Штейнброкеру.

При поступлении проведено обследова- 30 . ние по предлагаемому способу аналогично примеру 1, Получены результаты: спонтан- ный синтез ДНК лимфоцитами 389 имп/мин при доверительном интервале от 345-433 имп/мин. Спонтанная активность лимфоци- . 35 тов больного в культуре с преднизолоном

488 имп /мин. Полученные данные демонстрируют наличие стимулирующего -влияния преднизолона у данного больного, что предполагает диагноз ЮРА.. 40

Проведено обследование согласно известному способу аналогично примеру 1, Получены результаты: спонтанный синтез

ДНК 803 имп/мин, что превышает показатель М + 1 56 контрольной группы детей. равный 489 имп/мин. Полученные данные позволяют поставить.диагноз ОРА.

Проведено комплексное обследование, на основании которого мальчику выставлен диагноз ЮРА (контрольный диагноз). . Таким образом, отмечается совпадение диагноза, поставленного по предлагаемому и известному способам. с контрольным диагнозом;

Использование предлагаемого способа позволяет повысить точность диагностики на 41 за счет возможности выявления разбалансированности системы иммунорегуляции, характерной для.ОРА, и упростить способ за счет исключения необходимости обследования контрольной группы здоровых детей.

В табл; 1 дана оценка точности диагностики IOPA при использовании предлагаемого способа; в таба 2 — то же. при известном способе; в табл. 3 — сравнительная.оценка способов.

Формула изобретения

Способ диагностики ювенильного ревматоидного артрита путем исследования спонтанного синтеза ДНК в лимфоцитах периферической крови ин витро, отличающийся тем. что, с целью повышения точности диагностикИ, периферическую кровь обрабатывают предниэолоном в концентрации 0,1 мкг/мл и при изменении спонтанного синтеза ДНК в пробе после обработки преднизолоном диагностируют ювенильный ревматоидный артрит,.

1725132

Таблица 2

Т а б л и ц-а 3

Составитель В.Митюшин

Техред М.Моргентал Корректор Э.Лончакова

Редактор И.Шмакова

Заказ 1172 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-ЗБ, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r, ужгород, ул.Гагарина, 101