Способ отбора растительных форм, устойчивых к насекомым вредителям

 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для отбора растительных форм, устойчивых к насекомым-вредителям , при селекции. Целью изобретения является увеличение выхода устойчивых растительных форм и упрощение способа. Способ отбора растительных форм/устойчивых к насекомым-вредителям, предусматривает культивирование микрокаллусов на среде, содержащей на ниже сублетальной дозы нистатина, выделение жизнеспособных клонов, получение регенерантов растений с последующим анализом состава стеринов в растениях. При этом жизнеспособные клоны дополнительно обрабатывают ультрафиолетовым светом с мощностью светового потока 2 Дж/м2 с экспозицией 4-6 мин. 1 з.п. ф-лы, 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И. ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4777299/13 (22) 03.01.90. (46) 07.03.92. Бюл. N. 9 (71) Ленинградский государственный университет (72) С.Г. Мнге-Вечтомов, Л;А. Лутова, Е.А.

Левашина, Н.Л. Байрамова и Л.В. Бондаренко (53) 632.6(088.8) (56) Сидоров В,А. Соматическая гибридиза-, ция пасленовых, Киев,: Наукова Думка, 1985.

Lipids. 1980, v.150, М1,рр.50-54. (54) СПОСОБ ОТБОРА РАСТИТЕЛЬНЫХ

ФОРМ, УСТОЙЧИВЫХ К НАСЕКОМЫМВРЕДИТЕЛЯМ

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для отбора растительных форм, устойчивых. к насекомым-вредителям, при селекции.

Известны способы селекции растений, обладающих устойчивостью к насекомымвредителям, обусловленной измененным составом фитостеринов, которые основаны нэ использовании суспенэионных культур ln

vitro. Селекция заключается в отборе на уровне единичных клеток, что сопровождается низкой выживаемостью растительных клеток, в том числе и мутантных, и приводит к резкому снижению вероятности отбора клеток с нужными свойствами.

Известен способ селекции растений при. получении клеточных линий табака, имеющих измененный количественный состав фитостеринов. В известном способе в

5U 1717016 А1 (si)s А 01 Н 1/04, С 12 N 15/01 (57) Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для отбора растительных форм, устойчивых к насекомым-вредителям, при селекции. Целью изобретения является увеличение выхода устойчивых растительных форм и упроще-. ние способа. Способ отбора растительных форм, устойчивых к насекомым-вредителям, предусматривает культивирование микрокаллусов на среде, содержащей нэ ниже сублетальной дозы нистатина, выделение жизнеспособных клонов, получение регенерэнтов растений с последующим анализом состава стеринов в растениях. При зтам жизнеспособные клоны дополнительно обрабатывают ультрафиолетовым светом с мощностью светового потока 2 Джlм с экспозицией 4-6 мин. 1 з.п. ф-лы, 4 табл. качестве селективного агента среды применены полиеновые антибиотики нистанин и амфотерицин В. Клеточные линии получают с использованием суспензионных культур.

Недостатком известного способа является большая потеря мутантов в силу специфики роста растительных клеток in vitro, а также возможная утрата ими морфогенетических потенций, что исключает получение растений-регенерантов. Это приводит к длительным срокам селекции с нужными свойствами устойчивости, Целью изобретения является увеличение количества мутантных клеточных линий, сохраняющих способность к морфогенезу, и скорости их получения.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе отбора растительных форм, устойчивых к насекомым-вредителям, 1717016 в среде устанавливают не ниже сублеталь- 1 ной дозы для данной культуры.

Цель достигается также тем, что жизнеспособные клоны дополнительно обрабатывают ультрафиолетовым светом с мощностью светового потока 2 Дж/м с экс- 1 позицией 4-6 мин.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем. Каллусная ткань, полученная in vitro из частей проростков, по набору запасных веществ, составу фитосте- 2 ринов и другим свойствам соответствует целому растению и в качестве единственного источника питания может обеспечить нормальное развитие насекомого. Используя методы клеточной селекции, можно пол- 2 учить клеточные линии с измененным составом стеринов, а из них — растениярегенеранты, которые и будут влиять на развитие насекомых-вредителей посредством неполного удовлетворения пищевых по- 3 требностей насекомых. В предлагаемом способе мутанты получают с использованием микрокаллусов, Микрокаллусы — небольшие кусочки каллусной ткани размером 1,5 — 2 мм, светлые, рых- 3 лые, легко диспергируемые. Микрокаллус характеризуется высокой скоростью роста и первичную устойчивость растения можно оценить на 10-15-й день с момента посадки растительной ткани, тогда как при исполь- 4 зовании суспензионной культуры этот срок соответствует 30-40 дням. Применение нистатина в питательной среде в дозах, не ниже сублетальных, которые частично ингибируют рост микрокаллусов, обеспечивает 4 селекцию первично-устойчивых каллусов, дающих мутантные клеточные линии, сохраняющие нужный признак — устойчивость к насекомым-вредителям и на неселективных средах в дальнейшем. 5

Способ осуществляют следующим образом, В качестве растительного материала используют каллусную культуру, полученную из асептических проростков культуры на 55 среде для каллусообразования, например, RMN0 (3), содержащий фитогормоны (2,4дихлорфеноксиуксусная (2,4 — Д) кислота

0,1 мг/л, кинетин 0,04 мг/л,/ -индолилуксусная кислота (ИУК) 3 мг), или на среде Мурапредусматривающим культивирование растительных клеток на среде, содержащей нистатин, выделение жизнеспособных клонов, получение регенерантов растений с последующим анализом состава стеринов в растениях, в соответствии с предлагаемым изобретением, в качестве культуры растительных клеток используют культуру микрокаллусов растений, а содержание нистатина сиге — Скуга (4), также содержащей фитогормоны (6-бензиламинопурин (БАП) 2,5 мг/л и а-нафтилуксусную кислоту (НУК) 0,5 мг/л).

Для получения устойчивых к нистатину кле5 точных линий в среду для культивирования после автоклавирования добавляют нистатин в концентрации сублетальной, величина которой установлена экспериментально.

Так, для табака она составляет 50 мг/л, а для

0 гороха — 60 мг/л, и эти сублетальные концентрации не полностью подавляют рост растений, Культивирование проводят в чашках Петри. в каждую помещают по 22 микрокаллуса. За единицу варьирования при

5 анализе берут один микрокаллус, контролем служат микрокаллусы, растущие на среде без нистатина. Антибиотик нистатин, вносимый в питательную среду. растворяют в диметилсульфоксиде, а для контроля при0 меняют среду с диметилсульфоксидом (ДМЯО). Чашки Петри с каллусами помещают в термокомнату при 22 — 26 С в темноту.

Результаты культивирования оценива5 ют на 10 — 16-й день роста каллусов, Определя ют долю растущих каллусов по отношению к общему их числу. Сублетальной считается такая доза, при которой процент растущих микрокаллусов не

0 превышает 2 . Первичные каллусы пассируются на среду того же состава и каждое последующее культивирование осуществляют через 15-20 дней. Для увеличения количества устойчивых к нистатину

5 микрокаллусов растений используют ультрафиолетовое (УФ) облучение в экспозиции

4-5 мин, причем облучение проводятлампами с мощностью светового потока 2 Дж/м с на расстоянии 0,7 м над поверхностью

0 чаши.

Селекцию клеточных штаммов на устойчивость к нистатину проводят следующим об разом. Н а среде с н иста ти н ом растут только единичные микрокаллусы, первично5 устойчивые. Для уменьшения гетерогенности клеточной популяции. проводят субселекцию, Для этого из отобранного клеточного штамма, индивидуально от каждого, берут микрокаллусы и снова помещают

0 на среду с нистатином в той же концентрации. грассирование повторяют 2-3 раза, что приводит к уменьшению числа устойчивых штаммов, как правило, в 2-3 раза. Мутантная природа полученных штаммов изменений доказывается сохранением признака в неселективных условиях. Проверка этого . критерия осуществляется отбором микрокаллусов от каждого устойчивого штамма и пассивированием его на среде беэ нистатина, причем пассирование проводят дваж1717016 тывают и соотносят с числом 5 первичноустойчивых штаммов, Параллель10

20 признака на среде с нистатином;

В ходе осуществления способа необходим выбор сублетальной концентрации ни- 25 диапазоне 0,1-50 мг/л, причем нистатин, взятый в концентрации даже 0.1 мг/л, по- 30 давляет рост микрокаллусов и по мере увегороха на устойчивость с применением нистатина с активностью 5200 ед/мг. В среду, содержащую нистатин концентрацией 50

40 мг/л, в чашках Петри вносят 311 каллусов гороха линии 1-23/2, помещают чашки

Петри на термостатирование при 22-26 С в темноте. После культивирования в течение

15 дней отбирают первичноустойчивые кал- 55 лусы, способные к морфогенезу, и опредеды,а затем опять переносят на среду с нистатином. Выросшие штаммы на среде с нистатином относят к устойчивым клеточным линиям. Число таких штаммов подсчино ставят контрольный опыт — получение каллусов на среде без нистатина,. Чашки с каллуса контрольных и устойчивых штаммов на среде MS, содержащей 6-бензиламинопурин (BAP) в концентрации 1 мг/л, помещают на досветку и на 30-й день наблюдают появление растений-регенерантов, Для укоренения каждый побег отделяют от общей массы и переносят на среду.MS без фитогормонов. Для проверки сохранности признака у растения проводят морфогенетический цикл растение — регенерант — каллус. Для этого от каждого растения получают вторичный каллус и в соответствии с изложенной выше методикой с помощью микрокаллусов проверяют сохранность статина, ингибирующей рост микрокаллусов, При определении такой дозы используют концентрации нистатина в личения, концентрации антибиотика процент .растущих микрокаллусов резко снижается (табл.).

Пример 1. Испытывают влияние различных концентраций нистатина на рост микрокаллусов табака. Выявлено, что ингибирующая рост концентрация нистатина 60 мг/л, а сублетальная — 50 мг/л для нистатина с активностью 5200 ед/мг, при этом сублетальной концентрации соответствует около 2% растущих микрокаллусов после селекции (табл. 1), При активности нистатина 3200 ед/мг снижение растущих каллусов до 2 отмечалось при концентрации антибиотика 15 мг/л (табл. 1) Пример 2. Испытывают культуру ляют процентное отношение их к исходному количеству образцов. Для данной концентрации нистатина их количество равно 49,8% (по пяти опытам 32,4-54,3%).

R р и м е р 3. Испытывают культуру гороха 1-23/2 аналогично примеру 2, при концентрации нистатина 50 мг/л. Отобрано

20,4% растущих каллусов (по пяти опытам

18,3-24,2%).

Пример 4. Испытывают культуру гороха 1 — 23/2, аналогично примеру 2, с нистатином активностью 5200 ед/мг, концентрацией 60 мг/л. Берут 297 микрокаллусов, после культивирования отобрано 1,2 растущих каллусов (по пяти опытам 0,9-1,5 ).

Пример 5. Испытывают культуру гороха, аналогично примеру 2, с нистатином концентрацией 70 мг/л. Берут 326.микрокаллусов для культивирования, после 15. дней жизнеспособных каллусов не обнаружено (по пяти опытам 0,00-0,08 ).

Пример 6. Испытывают культуру гороха 1 — 23/2 на среде с ДМЯО, без нистатина, аналогично примеру 2; Берут исходно

174 микрокаллуса, после культивирования (через 15 дней) обнаружено 98,0% растущих микрокаллусов (по пяти опытам 96,8 — 99,8%).

Пример 7. Испытывают культуру гороха в контроле на среде без добавок аналогично примеру 2. Берут 230 микрокаллусов, и через 15 дней обнаружено растущих микрокаллусов 90% (по пяти опытам 85.4—

91,3%).

По примеру 2 — 7 делают вывод о влиянии нистатинэ на развитие микрокаллусов и устанавливают сублетальную дозу 60 мг/л при активности 5200 ед/мг, ингибирующую — 70 мг/л. Результаты сведены в табл. 2, Пример 8. Испытывают влияние

УФ-облучения в присутствии сублетальных концентраций нистатина на развитие растений и увеличение количества мутантных клеток табака. Микрокаллусы облучают

УФ-светом в течение 2-6 мин. При субселекции первичноустойчивых каллусов, отобранных по схеме примера 2, после

2-кратного -пассирования на среде, содержащей нистатин, отбирают устойчивые линии, сохранившие признак в неселективных условиях.

Берут исходных микрокаллусов 231, культивируют на среде с содержанием нистатина активностью 5200 ед/мг 50 мг/л, облучают растения УФ-светом в течение 2 мин. После селекции отбирают 2 первичноустойчивых каллуса, производят субселекцию, после которой устойчивых каллусов не сохранилось.

Пример 9. Испытывают влияние

УФ-облучения на развитие растений и увеличение клеточных линий табака, аналогично примеру 8, с облучением УФ-светом в течение 3 мин. Из исходных микрокаллусов после культивирования отобрано первично1-717016 устойчивых 3, устойчивых после субселекции каллусов не выявлено.

Пример 10. Испытывают влияние

УФ-облучения на табак, аналогично примеру 8, с облучением его в течение 4 мин, Из

231 исходного микрокаллуса после культивирования выявлено первичноустойчивых

9, устойчивых после.субселекции 3 и устойчивых после проверки в неселективных условиях 3.

Пример 11. Испытывают влияние

УФ-света на табак, аналогично примеру 8, с облучением в течение 5 мин. Из 320 исходных микрокаллусов отобрано первичноустойчивых 2, однако после субселекции устойчивых образцов не выявлено.

Пример 12. Испытывают влияние

УФ-облучения на табак аналогично примеру

8, с облучением в течение 6 мин, Из 231 исходного микрокаллуса отобрано первичноустойчивых 4, после субселекции устойчивых 2, и устойчивых после проверки в неселективных условиях 2.

Пример 13. Проводят опыт аналогично примеру 8 без УФ-облучения, Из 326 исходных микрокаллусов отобрано первичноустойчивых 2, а после субселекции устойчивых образцов не обнаружено.

По результатам примеров 8-13 делают вывод о влиянии УФ-облучения при мощности светового потока 2 Дж/м с экспозицией

4 — 6 мин в сочетании с культивированием на среде, содержащей нистатин в сублетальной для растения дозе, на увеличение количества устойчивых к нистатину клеточных линий, выдержавших проверку на устойчивость в неселективных условиях, Результаты опытов с табаком и горохом приведены в табл. 3.

Пример 14. У устойчивых растений табака и исходной клеточной линии, на которой они были получены, методами газовожидкостной хроматографии проанализирован состав стеринов. Ориентировочный состав стеринов проверяемый у растений, следующий: холестерин (1), кампестерин (2) стигмастерин (3), ситостерин (4) и другие (5)

Стерины испытанных растений в контроле распределились по позициям укаэанных стеринов следующим образом; 1 — 22, 2 — 21, 3 — 45, 4- 12, 5 — Oo .

Для растений-регенерантов (в контроле) соотношение стеринов: 1 — следы, 2—

30 3 — 44,4 — 25, 5 — Oo

Для нистатин-устойчивых клеточных линий: 1 — следы; 2 — 26, 3 — 21, 4 — 58 . 5—

0о

Для каллусов (в контроле), 1 — 14, 2—

28, 3 — 22, 4 — 36, 5 — 0%.

Для нистатин-устойчивых растений-регенерантов: 1 — 17%, 2 — 17o 3 — 53o 4—

8, 5 — Π.

Таким образом, все устойчивые к ниста5 тину клеточные линии и растения-регенеранты имеют измененный состав стеринов по сравнению с контрольными образцами.

Пример 15. У устойчивых растений гороха и исходной клеточной линии метода10 ми газово-жидкостной хроматографии проанализирован состав стеринов, Ориентировочный состав, проверяемый у растений, такой как в примере 14.

По позициям, указанным выше, стери15 ны испытанных растений распределились следующим образом: растения. (контроль): 1 — 210, 2 — 10%, 3 — 23%, 4 — 26, 5 — 20 ; каллус (контроль): 1 — 7, 2 — 9 „, 3—

20 10o 4 — 250, 5 — 49 нистатин-устойчивые клеточные линии, штамм 1:1-8%,2 — О,З вЂ” О . 4 — О, 5 — 92 0 ; штамм 2; 1 — 9%, 2 — 0%, 3 — 0% 4 — So, 25 5 — 830 : штамм 3 1 — 0%2 Oo 3 O o 4 38, 5 — 62 0 ; штамм 4: 1 — 8%, 2 — 15, 3 — 11%, 4—

28o 5 — 38o

30 Таким образом, все нистатин-устойчивые клеточные линии гороха имеют сущест- . венно иной состав фитостеринов по сравнению с контролем.

Результаты примеров 14 — 15 сведены в

35 табл.4.

Пример 16. Оценивают устойчивость полученных линий табака в системе растение-дрозофила (разработанная авторами эколого-генетическая система для тестиро40 вания растительных объектов). Устойчивость растений к насекомым-вредителям оценивают по плодовитости дрозофилы, для которой исследуемое растение (в виде микрокаллуса) является пищевым субстратом.

45 Достоверное снижение плодовитости дрозофилы служит доказательством устойчивости растения к насекомому-вредителю. поскольку жизнеспособность его зависит от содержания стеринов и их нормального со50 отношения в данном растении.

Для табака (каллусы в контроле) плодовитость мух составляет 38,0%, При содержании мух на мутантных клеточных линиях, нистатин-устойчивых, плодовитость состав55 ляет 6,2 и 8.4, что говорит о достоверном снижении плодовитости мух на нистатин-устойчивых линиях, Пример 17. Оценивают устойчивость клеточных линий гороха в системе растениедрозофила аналогично примеру 16. Плодо10

1717016

Таблица 1

Влияние концентрации нистатина на рост микрокаллусов табака

Вариант опыта Количество микро- Растущие никрокаллусы каллусов и доверительный интервал,е

98,3

96,г - 99,6

90,0

84,0 - 94, 7

Контроль

0ИВО

1го

Нистатин с активностью 3200 ед/мг

0,1 иг/л

23,3

18,6 - 34,7

48 39,6

263 -43,7

90 6,7

4,5 " 10,8

63 1,6

0>8 - 2,2 с активностью 5200 ед/иг

231

1 мг/л

10 иг/л

15 мг/л

Нистатин

30 мг/л

35 нг/л

45 иг/л

50 иг/л

81 ° 0

75,7 - 85,8

18,2

13,5 - 23,4 б,о

3,4 - 9.3

1,6

0,9 - 2,5 о,о

0,00 - 0 09

231

252 г5г

60 мг/л

252 витость дрозофилы на контрольном штамме составляет 49,0%, а на устойчивой клеточной линии — 13,6%, при этом наблюдается задержка в развитии и нарушение репродуктивной системы самок мух, 5

Таким образом, среди устойчивых к нистатину линий растений (например, табак, горох) есть такие, которые в целом и обеспечивают развитие дрозофилы, но с задерж- 10 кой, и снижают ее плодовитость, Изменение метаболизма фитостеринов в растении позволяет блокировать развитие насекомого.

Технико-экономическая эффективность прелагаемого изобретения по сравнению с 15 известным заключается в существенном ускорении и направленном отборе растительных форм, устойчивых к насекомым-, вредителям, за счет получения многочисленных растений-регенерантов на основе 20 отобранных устойчивых клеточных линий с использованием системы микрокаллусов.

Современная селекция растений, устойчивы к насекомым-вредителям, предусматривает получение, прежде всего, набора 25 растительных форм, подлежащих испытанию, из которых и выбирают устойчивые, причем результаты испытаний зависят от факторов внешней среды в гораздо большей степени, чем предлагаемый способ.

Для культур с длительным циклом развития предлагаемый способ представляется наиболее эффективным, и существенно снижающим затраты на проведение селекционной работы для всех культур.

Формула изобретения

1, Способ отбора растительных форм, устойчивых к насекомым-вредителям, ïðåдусматривающий культивирование растительных клеток на среде, содержащей нистатин, выделение жизнеспособных клонов, получение регенерантов растений с последующим анализом состава стеринов в растениях, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода устойчивых растительных форм и упрощения способа, в качестве растительных клеток используют микрокаллусы растений, а содержание нистатина в среде устанавливают не ниже сублетальной дозы.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода устойчивых растительных форм, жизнеспособные клоны дополнительно обрабатывают ультрафиолетовым светом с помощью светового потока 2 Дж/м с экспозицией 4-6 мин.. г

1717016

Таблица 2

Влияние изменения концентрации нистатина на рост микрокаллусов гороха (1-23/2) Количество растущих иикрокаллусов и доверительный интервал, Ф

Количество микрокаллусов

Вариант опыта

90, О.

85„4 - 91,3

98,0

96,8 - 99,8

230

Контроль

174

DMSO

311

"40 мг/л

283

50 мг/л

60 мг/л

32670 мг/л

««

Таблица 3

Влияние Уф-облучения на получение устойчивых к нистатину клеточных линий табака и гороха

Горох Табак

Иикрокаллусы

Доза Уф-облучения за время, Доза УФ-облучения за время, мин мин

«««««««

6 0 2 3 4 5 6

0 3 4

283 360

0 3

367

740 326 231 210 231 320 231

5 2 2 3 9 2 4

Исходные

Первичноустойчивые 6

Устойчивые после субселекции

3 0 0 0 3 0 2

Устойчивые после проверки в неселективных условиях в

3 0 0 0 3 0 2

Нистатин с активностью 5200 ед/мг

49,8

32,4 - 54,3

20,4

18,3 - 24,2

112

09 15

0,0

0,00 - ОФ08

1717016

Таблица 4

Содержание фитостеринов в тканях табака и гороха .(ь) Содержание фитостеринов, Культура

Ситостерин Другие

1,58 >1,7

Кампастерин Стигмастерин

1,28 1,70

Холестерин

1 O+

Табак

Растение (контроль) 12

30

Следы

Каллус (контроль) 28

14.22

53

Следы

17

Горох

Растение (контроль) 26

21

23

25

7 линии:

83

8 15 11

П р и м е ч .а н и е. + - относительное время удержания стеринов по холестерину.

Редактор Э.Слиган

Заказ 822 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород. ул.Гагарина. 101

Растение-регенерант (контроль) Нистатин-устойчивая клеточная линия

Нистатин-устойчивые растениярегенеранты

Каллус (контроль)

Нистатин-устойчивые клеточные штамм 1 штамм 2 штамм 3 штамм 4

Составитель Н.Кузенкова

Техред М.Моргентал Корректор Т.Палий б