Способ определения антител в твердофазном иммуноферментном анализе

 

Изобретение относится к иммунодиагностике и может быть использовано в методах иммуноферментного анализа и иммунодиагностике заболеваний человека и животных, в сероэпидемио логин, экспериментальной иммунохимии и биотехнологии. Цель изобретения заключается в повышении точности определения антител в твердофазном иммунофермснтном анализе. Сущность изобоетения заключается в том, что поел0 сорбции антигена на твердой фазе и янесения исследуемых антител в пробу добавляют раствор, содержащий 0,5-2,ОМ мочевину и обработанную пепсином сыворотку крови млекопитаюших и концентрации 1-2%, а в раствор конъюгата белок А-пероксидаза вносят мочевину в концентрации 0,2-0,5М.Повышение точности определения антител подтверждено примерами. 2 табл. f.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (5I)5 С 01 11 33/535

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (2lj 4652196/14 (22) 12.01.89 (46) 30.04.9I. Бюл. I )6 (7)) Научно-исследовательскии институт эпидемиологии и микроби .лоджии им. Пастера (72) A.Á.Æåáðóí, Г.Ф.Быстрова и М.В.Полосатов (53) 615:373 (088.8) (56) Жебруч А,Б. Твердо, азный ноферь ентный анализ. Труды инсти-.ута им. Пастера том.64. Л.. )988, с. 84-89. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕ))ИЯ АНТИ.ЕЛ В

ТВЕРДОФАЗНОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИВЕ (57) Изобретение относится к иммунодиагностике и может быть использовано в методах иммуноферментного аналиИзобретение относится к иммунологцИ и может быть использовано в методах иммуноферментного анализа (ИФА), в иммунодиагностике заболеваний человека и животных, в сероэпидемиологии, экспериментальной иммунохимии и биотехнологии.

Цель изобретения — повышение точности твердофаэного ИФА для определения антител.

Цель достигается тем, что антитеяосодержащий материал контактируют твердофазным антигеном в присутствии мочевины в концентрации 0,52,0 моль/л и обработанной пепсином сыворотки крови млекопитающих в конечной ее концентрации IX, а в рабочий раствор конъюгата белок А-перок„„SU„„1645898 А 1 з а в нммучодиагно стике < аболев аний человека и животных, в сероэпидемиологии, экспериментальной иммунохимии и биотехнологии. Цель изобретения заключается в повышении точности

n ".ð,äåëåHHÿ антител в твердофазном иммунофермснтном анализе ° Сущность изобретения заключается в том, что посл-" сорбиии антигена на твердой фазе и вне ения исследуемых антител в пробу добавляют раствор, содержащий 0,5-2,0М мочевину и обработанную пепсином сыворотку крови млекопитающих и концентрации 1-27., а в раствор коньюгата белок А-пероксидаза вносят мочевину в концентрации 0,2-0.5М,Повышение точности определения антител подтверждено примерами. 2 табл. сидаза вносят мочевину в концентрации 0,2-0,5 моль/л, Способ осуществляется следующим

06pQ3OM

I,). Твердофазный антиген получа-ют посредством сорбцни антигена в полистирольных плоскодонных планшетах для иммунологических реакций (Ленинградский завод "Медполимер"), Раствор антигена в объеме 0,1 мп выдерживают в лунках планшета 18 ч при

4 С, после чего его удаляют. о

1 .2. Для блокады остаточной сорбции в лунках вносят в них по 0,15 мл

0,5 Х-ного раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) в глициновом буферном растворе (ГБР) следующего состава, моль/л: глнцин О, 1; хлорид! 645898 натрия 0,15, рН 8,2 ° Зтот раствор вы— держивают в лунках 1 ч при 20-24 С, затем удаляют.

1.3 ° Проводят 4-кратную промывку лунок рабочим буферным раствором (РБР) следующего состава: фосфатный буферный раствор (рН 7,2-7,4)

0,01; хлорид натрия 1Х; БСА

0,057; твин-20 0,05Х. На каждую про- !О мывку расходуют по 0,15 мл РБР.

1.4. Затем в лунки планшета вносят исследуемые сыворотки: согласно прототипу — сыворотки предварительно разводят в 100 раз рабочим буфер- !5 ным раствором и вносят в лунки в объеме 0,1 мл; согласно предлагаемому способу — первичные неразведенные сыворотки вносят непосредственно в лунки планшета в объеме 0,01 мл и до- 2р бавляют 0,09 мл разбавляющего раствора (РР) следующего состава: мочевина 1,0 моль/л; хлорид натрия

0,15 моль/л; твин-20 0,5 г/л; нормальная лошадиная сыворотка,обрабо- 25 танная пепенсином )О мл/л PP.

Обработку нормальной лошадиной сыворотки производят предварительно, заготавливая впрок. Для ее получения к нативной сыворотке добавляют крис- 3р таллическую лимонную кислоту до рН

4,0-4,5 и 5 мг/мп пепсина очищенного кристаллического. Смесь выдерживают при 18-24 С 1 ч и прогревают при

58 С 45 мин, затем центрифугируют при 4-5 тыс.об. 30 мин, осадок удаляют, а надосадочный слой диализуют против 0,2 М фосфатно-буферного раствора рН 8,2. Полученную диалиэованную ферментированную сыворотку хранят в 40 присутствии мертиолата (при его конечной концентрации 0,01X) в течение 1 г °

Исследуемые сыворотки выдерживают в лунках планшета 30 мин при 37 С,за- 45 о тем содержимое лунок удаляют и проводят промывку (как указано в п. 1. 3) .

1.5. В лунки планшета вносят конъюгат белок А-пероксидаза хрена (производства ЛенНИИЭИ им.Пастера), приготовленный на РБР,содержащем

0,2 моль/л мочевины. Концентрация конъюгата — 100 нг действующего нача-. ла на 1 мл раствора; объем, вносимый е лунку — 0,1 мл . Раствор Knows 55 гата выдерживают в лунках 15 мин при

° 18-24оС и повторяют промывки (п.1.3), 1.6. В лунки планшета вносят по

0,1 мл хромогенсубстратной смеси, приготовленной непосредственно перед использованием следующим образом: в !

О мп 0,2 моль/л цитратно-фосфатного буфера рН 5,0 растворяют 1 мг ортофенилендиамина и 0,01 мл ЗОЖ-ного раствора перекиси водорода. Смесь выдерживают в лунках 15 мин в темноте при

13-24оС, затем реакцию останавливают добавлением 4н. раствора серной кислоты по 0,1 мп в каждую минуту и результаты анализа фотометрируют на спектрофотометре любой конструкции ("Иультискан", АИФ-Ц-0,1С и т.п.) при длине волны проходящего света

492 нм. !.7. Уровень фонового сигнала определяют в контрольных лунках планшета, в которых выполняют все изложенные операции, за исключением операции 1.1, т.е. антиген не сорбируют в лунке планшета.

1.8. Результаты учитывают следующим образом: положительными считают те реакции, в которых оптическая плотность продукта реакции выше таковой в контрольной лунке (вьппе фонового сигнала той же сыворотки) в

2,5 и более раз; сомнительными — реакции, где оптическая плотность выше фонового сигнала менее, чем в 2,5, но не более, чем в 2 раза; отрицательными — реакции, в которых оптическая плотность выше фонового сигнала менее, чем в 2 раза.

Пример 1. Определяют противодифтерийные антитела в сыворотках подростков 13-14 лет; а) в группе сывороток, содержащих антитоксические антитела в количествах 0,1-0,3 Ие/мл по результатам предварительно проведенной биопробы на кроликах; б) в группе сывороток, не содержащих антитоксических антител по данныи той же биопробы.

Твердофазный антиген получают посредством сорбции дифтерийного анатоксина (0,1 мл раствора, содержащего

5 мкг антигена-анатоксина в 1 мл в

ГБР) в течение 18 ч при 3 С.

Все остальные операции анализа проводят, как изложено в пп. 1..2-1.8, с теми отличиями, что на стадии контактирования исследуемой сыворотки с твердофаэными антигеном варьируют состав PP — используют ферментированные и неферментированные сыворотки разных видов и в разной концентрации.

Как видно из табл.2, положительный эффект повышения точности и сни5 164589

Результаты зависимости И ьА от характера и концентрации сыворотки,вводимой в разбавляющий раствор,предстан— лены в табл.l (свидетельствуют о более высокой точности).

Все 54 серопозитивные сыворотки предлагаемого способа по сравнению с прототипом тестируются правильно, нсе серонегативные не дают ложноположительных результатов. В прототипе 5 сывороток ошибочно тестируются как отрицательные и 2 — как сомнительные (вариант 9).

Положительный эффект в предлагаемом способе достигается при использовании ферментированной сыворотки лошади и кролика — без существенных различий между вариантами 1 и 2. Иеферментированная (нативная) сыворот- 20

p à (вариант 3) не дает эффекта существенного улучшения ИФА: 6 серопозитинных и 3 серонегатинных сыворотки определяются как сомнительные ввиду высокого уровня фонового сиг- 25 нала. Без добавления сыворотки (нариант 4) возрастает число проб с высоким фоновым сигналом, н результате точного аначиза хуже, чем н про то типе . 30

Варианты 6-7 демонстрируют зависимость результата ИФА от концентрации ферментиров анной сыворотки в составе РР ° Надежный эффект повьппения точности ИФА отмечают при концентрации ферментированной сыворотки 17, более высокие ее концентрации сушественного эффекта снижения фонового сигнала не дают, поэтому нецелесообразны.

Вариант 8 демонстрирует тот факт, что ферментированная сыворотка дает эффект повьппения точности ИФА только в сочетании с мочевиной в составе

PP. В отсустние моченины из-за высо- 45 кого уровня фононого сигнала 2 про ы из 4 тестируются как отрицательные и 6 проб — как сомнительные.

Пример 2. Определяют противодифтерийные антитела н 51 сынорот- 5р ке, положительной по данным антитоксического теста на кроликах.

Условия проведения и зависимость результатов ИФА от вводимых ингредиентов рабочих растворов и их концентрации, приведены н табл.2.

3 6 жения фононого сигнала дает применение н составе РР моченины н концентрациях 0,5-2,0 моль/л (н сочетании с 17.-ной ферментированной сывороткой лошади или быка). Более высокие кон. центрации мочевины снижают специфический сигнал и приводят к появлению сомнительных и отрицательных результатов °

Варианты 14-18 данного примера доказывают положительный эффект,созданный в предлагаемом способе присутствием моченины í рабочем растворе коньюгата, начиная с ее концентрации 0,2 моль/л и до концентрации

0,5 моль/л. Дальнейшее увеличение концентрации моченины не дает положительного эффекта, а, напротив,снижает абсолютный уровень специфического сигнала.

П р и и е р 3. Определяют антитела к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ). В качестве ВИЧ-положительных и ВИЧ-отрицательных сывороток крови беременных женщин используют образцы сывороток из набора П1СК МЗ СССР (подтнержденных совпадающими данными

ИФА с референс-тестсистемами и данными иммуноблоттинга).

Тнердофазный антиген готовят из синтетических пептидов †аналог антигенных детерминант ВИЧ из набора тестсистемы нЭпитоп" путем их сорбции н лунках планшета для иммунологических исследований в концентрации 15 мкг пептидов в 1 мл. Далее

ИФА выполняют, как указано в пп.l.l

1.3. Получают доказательства повышения точности и специфичности предлагаемого способа, который дает полное выявление всех сероположительных лиц (на 5 человек больше, чем прототип) и лишен ложноположительных результатов при анализе сывороток беременных женщин (прототип и этой группе обследуемых регистрирует

6 случаев "ложноположительных" реакций и 2 случая сомнительных — 6X и

2X — соответственно от объема выборки). Таким образом, предлагаемый способ дает воэможность исключить ложноположительные реакции и дополнительно выявить носителей антител к ВИЧ. Оба преимущества .имеют принципиально важ-, ное значение для правильной организации противоэпидемических мероприя тий против СПИД.

1645898

Таблица!

Характеристика ис следуемых сывороток крови доно ров по данным биопробы

"eoH" ОЛ,92„

Всего Всего полови сомнительных тельных

Всего

- 492. ям

Характеристика сыворотки в PP отрицательюях г

Пределы М кол еб аний рн ант

Пределы колебаний составе о о о о

0,04-0,07

0,05-0,09

0,06

0,91 0,63-2,0

0,08 0,07-0,11

Серопозитивиые

Серонегативные ьермеитироваиная лоО,О7

l9 шадиная, 1Х

2 То ке, кроличья о

0,02-0,07

0,88 0,58-2,0

0,05

Серопозитивные

Серонегативные

Серопозитивные

Серонегативные

О,О1-O,О8

0, 10-0> 37

0,16-0,34

0 19

6 О

3 l6

5 4

0,04

0,09 0,06-0,)2

0,36 0,73-2,0

0,29 0,2!-0,37

1,17 0,33-2,0

3 Нативная лошадиная,II

48 о,гз

0,26

4 Без сыворотки

Серопозитивные

Серонегативные

Серопозитивные

Серонегативные

0,23-0,71

0,29

4 15

z о

О 19

0,19-0,63

0,14-0,29

O,З8 о,г1

0,34 0,19-0,72

0,97 0,75-2,0

19

5 Ферментированная лоО ° 19 0 12-0 21

0,21 0,11-0,29

19 шадиная, О ° 051

6 То ае,2Х о - о

0 19

0,03-0, 19 о,nI-O, »

0,02-0,10

0,02-0,11

0,05

О 93 О 79-2 0

0,07 0 03-0,09

0,92 0,81-2,0

О 07 0 02-0 09

Серопозитивные

Серонегативные

Серопознтивные

О,О4

54

О;06

7 То ae,ÇÕ

19

О,O5

Серонегативные

Пример 4. Выполняют в точном соответствии с предыдущим примером, исследуя тот же материал на наличие антител к ВИЧ. Отличие состоит в том, что для получения твердофазноro антигена используют антигенные детерминанты ВИЧ иэ иммунодиагности-:.: кой тестсистемы "Пептоскрин-1". Получают следующие результаты: иэ 100 исследуемых ВИЧ положительных сывороток известным способом правильно тестируют 88 (887), 12 сывороток (127) тестируют как отрицательные. Все cblворотки здоровых доноров и беременных женщин известным способом тестируются как отрицательные.

Предлагаемый способ правильно тестирует 98 ВИЧ-положитепьных сывороток иэ 100, т.е. точность способа повышается до уровня рекомендованного комитетом экспертов Всемирной

Органиэации Здравоохранения. Сыворотки здоровых доноров и беременных женщин тестируются беэ ошибок как отрицательные.

Таким образом, выполненные примеры демонстрируют повьппение точности И<ьА.

Кроме того, важными являются еще два результата — снижение уровня фонового сигнала в ИФА и снижение его трудоемкости за счет устранения операции промежуточного разбавления исследуемой сыворотки) . Способ осуществим при определении антител различной специфичности и различных биологических видов.

Ф о р м у л а и э о б р е т е н и я

Способ определения антител в твердофазном иммуноферментном анализе, 15 включающий сорбцию антигена на твердой фазе, внесение исследуемых антител и детекцию комплекса антиген антитело в пробе с помощью обработки раствором конъюгата белок А-перок70 сидаза и спектрофотометрической регистрации продукта пероксидазной реакции, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения после внесения исследуемы7 антител в пробу добавляют раствор, содержащий 0,5-2,0 М мочевину и обработанную пепсином сыворотку крови млекопитающих в концентрации 1-27.з а в раствор конъюгата вносят мочеви30 ну в концентрации 0,2-0,5 11.!

645898

Продол7кение табл. 1

ВаФ 012enкм

"Опыт ОД

Всего Всего

Характеристика сыворотки в PP

8сеео полови телънык

Характеристика ucl следуе>е>к смвороток крови доноров по данным биопробы

PN

° ит со>еюи- отрнцетельнмк тель!и>к

Пределы колебаний

Пределы колебаний составе

0,46 0,29"0,53

0,39 0,28-0,48

О> l7 О, 12-0,24

0,11 0,09-0,12

8 Tore, I I, Серопови5es моче- тинные вины в PP Серонегатнвнме

9 Прототип Серопоаитнвные. ьСеронегатнв!пюе

0,092 0,89-2,0

0,33 0,29-0,49

0,5 1 О ° 31-0,92

5 2

19

47

l9 0,18 0,12-0,21

О

П р н и е ч ° и и е: ОДебь- оцтическан плотность продукта реакции при длине волны 492 вм;

Н - Holte — средний уровень ОД49В по группе сыворотки. таблица 2

ОДфт1 км

Пределы колебаний

"Опыт"

Ферментнрованная смворотка в PP

Хонцентрацня мочевнСомОтрицательряс творе ко иъигата, молекул

1 Ночевииа 0,2 Лонадн0,2

4о

0,24

2 О

0,78-2,0

0,96

0,11-0, 39 ная

It-ная

Tore

0,75-2,0

0,71-2,0

0,70-2,0

0,68-1,80

0,51-1,80

0,39-1 ° !д

0 25-0,7!

О,дд-2,0

Бычъя

II-ная

0,85-2, О

0,79-1,94

0,80-1,76

0,31-0,91

0,72-2,0

0,71-2,0

0,70"2,0

0,71-2,0

О ° 4д-i,á! °

1 °

° 1

11! ° !

Составитель А.Скурат

Техред А.Кравчук

Корректор С.Шекмар

Редактор И.Келемеш

Заказ !348 Тирам 4!7 Подпис но е

ВНИИПИ Государственного комитета по иэобретениям и открь2тиям лри ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, РаУепскаЯ наб > а д. 4/5

Проиэводственно-иэдательский комбинат "Патент", г.Укгород, ул. Гагарина, 101

Венес тво, в сиыое в PP и его концентрация > моль lл

2 То re

4

6

11

10 ! 11 н

13

14

11

16

7 -н18

0,5

О,д

1,0

1,5

2,0

2 ° 2

2,4

0,3

0,5

1 ° О

2,0

2,3

1,5

То re

° 1

° и

° !!

О ° 2

О ° 2

0>2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

О

0,1

0,2

О, 5.

0,7

0,93

0,&9

0,91

0,39

0,86

0,70

0,51

0,32

1, !4

О ° 83

0,82

0,61

0,91

0,93

0,89

0,82

0,3

0,12

0, l l

0>10

0,00

0>l l

0,09 0,07

0,26

0,14

0,10

0,1l

0,12

0,22

0,16

0,09

0,09

0,07

0,г>8-О,18

0104-0,15

0,03 -0,!2

0>45-0,18

0,04-0,18

0,03-0,16

О ° 04-0,13

О, Io-0,33

О, 10-0,17

0,06-0, 16

0> 09-0> 13

0 ° 07-0,16

0,16-0>29

0,12-0 ° 28

0,07-0,1 1

0,07-0 ° 12

0,03-0,09

51

51

51

51

51

48

51

51

51

49

4&

51

51

О О

0 О

О

П !! A !

I 2

I 0

0 0

0 О

0 0

1 I

3 A

>Е

О О

0 0