Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l. - продуцент моноклональных антител к дифференцировочному антигену @ -лимфоцитов человека

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к гибридомной технологии и может быть использовано для идентификации злокачественных клеток. Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (Мон-АТ) к дифференцировочному антигену /J-лимфоцитов человека, экспрессированному на различных стадиях дифференцировки/ -клеток. Штамм получен при соматической гибридизации клеток мышиной миеломы 653.А и клеток селезенки мыши линии BALB/c, иммунизированной клетками селезенки больного волосатоклеточным лейкозом. Клетки штамма, сектерированные Мон-АТ. принадлежат к классу lgG2s и обозначены ИПО-24. Культуральные свойства штамма типичны для гибридов, секреция Мон-АТ составляет 10-15 мкг/мл в культуральной жидкости и 5-10 мг/мл в асцитической жидкости. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) 240Д. Мон-АТ специфичны к дифференцировочному антигену / -лимфоцитов человека .

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4780344/13 (22) 08.01,90 (46) 15.01.92. Бюл. М 2 (71) Институт проблем онкологии им. P.Е.Кавецкого (72) С.П.Сидоренко, Е.П.Ветрова, Л.Н.Шлапацкая и А.Г.Бердова (53) 578.085.23 (088.8) (56) Stashenko P. et al J.lmmunol. 1980, 125, N. 4. р. 1678 — 1685. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS

MUSCULUS L. — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНОМУ АНТИГЕНУ P-ЛИМФОЦИТОВ

ЧЕЛОВЕКА. (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к гибридомной технологии и может быть использовано для идентификации злокачественных клеток. Целью изобретения является получение штамма

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к гибридомной технологии, и может быть использовано для идентификации злокачественных клеток.

Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (Мон-AT) к дифференцировочному антигену P -ïèìôîöèòà человека, экспрессированному на различных стадиях дифференцировки P клеток.

Штамм гибридных клеток получают следующим образом.

Мышей линии Balb/с иммунизируют внутрибрюшинно клетками селезенки больного волосатоклеточным лейкозом, дозы

1,6 — 12х10 клеток 3 раза с интервалом 30

7 дней и внутривенно по 10-10 клеток через

4 недели после внутрибрюшинной иммуни„„SU „„1705343 А1 (sl)s С 12 N 5/18, А 61 К 39/395 гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (Мон-AT) к дифференцировочному антигену j3-лимфоцитов человека, экспрессированному на различных стадиях дифференцировки/З-клеток.

Штамм получен при соматической гибридизации клеток мышиной миеломы 653.А и клеток селезенки мыши линии BALB/с, иммунизированной клетками селезенки больного волосатоклеточным лейкоэом. Клетки штамма. сектерированные Мон-AT. принадлежат к классу 1962в и обозначены ИПО-24.

Культуральные свойства штамма типичны для гибридов, секреция Мон-AT составляет

10-15 мкгlмл в культуральной жидкости и

5 — 10 мгlмл в асцитической жидкости.

Штамм депонирован под номером ВСКК(П)

240Д. Мон-AT специфичны к дифференцировочному антигену j3-лимфоцитов человека. зации. Через 4 дня после внутривенного введения клеток проводят соматическую гибридизацию клеток селезенки мыши— самки линии BAIB/c, предварительно осажденных в растворе Percoll (d = 1,065), с клетками мышиной миеломы 653. А.

Для получения раствора Percoll (d =

1,065) используют (d = 1,13) (Parmacia), 18 мл который смешивают с 2 мл 10х — PBS и 19 мл

Ix — PBS. В дальнейшем 2х10 клеток селезенки мыши ресуспендируют в 4 мл приготовленного раствора Percoll (d = 1,065), Наслоив на полученную суспензию клеток селезенки 1 мл среды RPM1-1640. клетки центрифугируют 19 мин при 400g (t = 20 С).

Полученный осадок клеток отмывают 3 раза в теплой среде ДМЕМ. 6х10 отмытых кле7 ток селезенки гибридиэуют с 4х10 клетск

1705343 миеломы 653. А с помощью 507(,-ного полиэтиленгликоля м.м. 1500 (Loba Chemla).

Клетки разливают в 96-луночные пластиковые плоскодонные планшеты (Limbro). Для культивирования гибридных клеток на первых этапах используют среду ДМЕМ с 15 (, лошадиной сыворотки (Serva). После слияния в культуры клеток в течение 2-х недель добавляют НАТ-среду, конечная концентрация гипоксантина 10 7 М, аминоптерина

4х10 М, тимидина 1.6х10 М, а затем в течение 1 недели НТ-среду. После селекции гибридов в НАТ и НТ-средах рост клонов гибридом выявляют в 270 из 672 лунок, Скрининг специфической антительной активности проводят методом иммунофлуоресценции в непрямом варианте на монослое живых клеток больного волосатоклеточным лейкозом. Клетки прикрепляют на предметные стекла, обработанные раствором поли- L-лизином (100 g) мл, м,м, 40000-80000).

При иммунофлуоресцентном анализе супернатантов гибридом специфическая антительная активность обнаруживается в

152 лунках, а при клонировании способность синтезировать антитела сохраняется

21 клон. Клонирование методом лимитирующих разведений проводят два раза с использованием перитонеальных макрофагов мышей BAIB/с в качестве фидера. После реклонирования и пассирования In vitro отбирают 1 клон гибридомы, клетки которого активно продуцируют антитела к поверхностному антигену клеток селезенки больного волосатоклеточным лейкозом. Штамм дипонирован под номером ВСКК (П) 240 в ин-те цитологии АН СССР, и получил название

И ПО-24, Штамм гибридных клеток характеризуется следующими свойствами.

Культуральные свойства и условия культивирования.

Культивирование in vitro в больших обьемах проводят в 50 Mll пластиковых и стеклянных флаконах и матрасах в среде ДМЕМ или RPM1-1640 с 10 донорской телячьей сыворотки (Serva), Штамм проходит более

40 пассажей In vitro, посевная доза 100 тыс. клеток на 1 мл, клетки пассируют раз в 3 — 4 дня, кратность рассева 1:7. Оптимум температуры 37 С, оптимум рН от 6,8 до 7,5. При росте на пластике клетки образуют монослой, к стеклу клетки прикрепляются слабо и в стеклянных флаконах растут в суспензии. Культивирование в организме живот н ых.

Для выращивания асцита мышам линии

BAIB/ñ эа 7-30 дней до иньекции вводят внутрибрюшинно пп 0.5 . 2.6, 10,14"" тет5

Пример 1. Клетки гибридомы ИПО—

24 в концентрации 2х10 /мл культивируют при 37ОС в 50 мл пластиковом флаконе в среде RPMI-1640 ("Gibco", Великобритания) с 10 (, инактивированной прогреванием при раэтилпентадеквна или вазелинового масла, Клетки инъецируют внутрибрюшинно по

10 клеток в 5 мл среды Игла. Асцит формиб руется через 12-14 дней в количестве 4 5 мл.

Биосинтез полезного продукта.

Секреция Мон-AT, обозначаемого ИПО24, на 3-4 день культивирования составляет

10-15 мкг в 1 мл культуральной среды и 5-10 мг в 1 мл асцитической жидкости. Продукция Мон-AT сохраняется как минимум до 45 пассажей ln vitro и до 4-х пассажей в асцитной форме.

Криоконсервирование. Для длительного хранения клеток штамма клетки замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 107, ДМСО, Режим замораживания: 4 /мин до+4 С, затем

1 /мин до — 70 С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание на водяной бане при 37 С. Жизнеспособность клеток после размораживания

70-807 по окрашиванию трипановым синим.

Морфологические свойства, При морфологическом исследовании клетки гибридомы преимущественно среднего размера бластные клетки со средним ядерно — цитоплазматическим отношением, с довольно нежной структурой ядерного хроматина. ободком базофильтной цитоплазмы, не содержащей зернистости. Ядро округлое или бобовидное. При цитохимическом исследовании в клетках гибридомы выявлена умеренная активность ферментов кислой фосфатазы и неспецифической — нафилацетатэстеразы.

Контаминация, При длительном наблюдении в посевах на питательные среды бактерии и грибы в культуре не обнаружены.

Характеристика полезного продукта.

B результате изучения специфичности

MKAT-ИПО-24 установлено, что определяемый ими антиген обнаруживается на поверхностных мембранахф-клеточных линий

САВП, Dandi, Ra|i и отсутствует на Т-клеточных линиях различной степени зрелости

НИТ, 1301, СЕМ, МТ4, Н9, MOTT-4.

МКАТ ИПΠ— 24 также не взаимодействуют с линиями клеток нелимфоидной природы MEWo. А — 431 и линией клеток, полученной от больного миеломной болезнью — RPMI-8826, Штамм секретирует МонAT класса FgG2b

1705313

Клетки инкубируют на предметном стекле 45 мин при 37 С во влажной камере.

Промывают препарат в 3-х стаканчиках со средой, Наносят по 0,05 мл супернатанта гибридомы ИПО-24 на каждую лунку. Инкубируют 20 мин при 37 С, отмывают в 3-х стаканчиках со средой. Затем наносят меченую FITC кроличью сыворотку против мышиных иммуноглобулинов в разведении

1:16 по 0,05 мл на лунку. Препарат инкубируют 20 мин при 37 С во влажной камере.

Затем промывают препарат в трех стаканчиках с ГЛАРХ, высушивают на воздухе, удаляют пэрафильм и наносят 50 глицерин в

PBS. Покрывают препарат покровным стеклом и эапаивают парафином. Препарат исследуют в люминесцентнам микроскопе

МЛ-2 при увеличении х QOO. Для воэбуждеРезультаты: свечение в виде зеленого ободка наблюдают на 10 клеток, т,е. клетки линии Н9 не несут поверхностный антиген, выявляемый Мон-АТ ИП0-24.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК (П) 240

О-продуцент моноклональных антител к дифференцировочному антигену Р-лимфо«итов человека.

Составитель А,Маныкин

Редактор М.Васильева Техред М,Моргентал Корректор М.Кучерявая

Заказ 170 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская. наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

56 С в течение 40 минут сыворотки крови крупного рогатого скота и 100 мкг/мл гентамицина (Pharma — chlm, Болгария).

На третьи сутки после смены среды из флакона отбирают 3 мл культуральной среды, центрифугируют ее при 8х10 об/мин в з течение 10 мин, В полученный супернэтант добавляют 15 М йайэ и используют в реакции непрямой иммунофлуоресценции, Разрезают полоску Parafllm M (American Can Company, США) размером

15х45 мм, Делают пробойником 4 отверстия диаметром 5 мм, Положив полоску на стекло. расплавляют парафильм M на электрической плитке, В лунки заливают раствор поли-1 -лизина (100 мкгlмл) ("Sigma", CWA) в среде 0,57, гидролизат лактальбумина в растворе Хенкса (Гларх), Инкубируют 60 мин при 37 С во влажной камере. Затем стекла промывают средой ГЛАРХ и используют для нанесения суспенэии клеток — мишеней, В качестве клеток — мишеней используют культуру В-клеток человека Rajl. Клетки, культивируемыв in vitro, отбирают из флакона. 3-кратно отмывают путем центрифугирования при 1,5х10 об/мин в течение 5 мин и э ресуспендируют в ГЛАРХ. доведя концентрацию клеток до 4х10 /мл.

35 ния люминесценции синефиолетовыми лучами используют светофильтр, предохраняющий препараты от выцветания Исследуют

400 клеток.

Результаты: свечение в виде ободка зеленого цвета наблюдают на 55,1 ф клеток, т.е, 55,1 клеток линии несут поверхностный антиген, выявляемый Мон-AT ИП0-24.

Пример 2. Иэ флакона с культурой

Т-клеточной линии Н9 ои отбирают 3 мл суспензии, 3-кратно отмывают от культуральной соеды путем центрифугирования при 1,5х10 o6/мин в ГЛАРХ и ресуспендируют в ГЛАРХ.

В лунки на предметное стекло, подготовленное для реакции иммунофлуоресценции также, как и в примере 1, наносят клетки линии Н9 в концентрации 4х10 /мл. Препа5 рат инкубируют 45 мин при 37 С во влажной камере, Промывают препарат в 3-х стаканчиках с ГЛАРХ. Наносят по 0,05 мл супернатанта гибридомы ИПО-24. Супернатант получают так же, как и в примере 1. Инкубируют 20 мин при 37 С во влажной камере. отмывают в трех стаканчиках в с ГЛАРХ.

Наносят меченую FITC кроличью сыворотку против Ig мыши в разведении 1:16 по

0,05 мл на лунку. Препарат инкубируют 20 мин при 37 С во влажной камере, а затем отмывают в трех стаканчиках с ГЛАРХ и высушивают на воздухе. Удаляют парафильм, наносят 507,-ный глицерин ía PBS, покрывают препарат покровным стеклом и запаивают парафином. Исследуют препарат при увеличении х 900 в люминесцентном микроскопе.