Штамм культивируемых клеток человека - продуцент многоклональных антител к д-антигену системы резус человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения резус-принадлежности крови и для профилактики сенсибилизации резус-отрицательных женщин при резус-несовместимой беременности. Целью изобретения является создание штамма культивируемых клеток человека, продуцирующих моноклональные антитела (Мон-АТ) к D-антигену системы резус человека. Линия получена в результате трансформации вирусом Эпштейна-Барр лимфоцитов периферической крови резус-отрицательного донора, иммунного против D-антигена. Штамм получил название D-89/H6 и депонирован под номером ВСКК(П) 390Д. Мон-АТ относятся к иммуноглобулинам класса Сив стандартных серологических тестах позволяют с высокой чувствительностью выявлять D-антиген и его слабые формы (0й), что часто невозможно с помощью стандартных изоиммунных сывороток. Условия культивирования типичны для гибридов, титр Мон-АТ в культуральной жидкости составляет 1:4096. 2 табл. со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4754726/13 (22) 05.10.89 (46) 23.09.91. Бюл, М 35 (71) Всесоюзный гематологический научный центр (72) Е.И.Дерюгина, Н,И.Оловникова, Г.А.Удалов, И.Л,Чертков и И. M Гуртовой (53) 578.085.23 (088.8) (56) Thompson К.М. et а1. Immunology. 1986, ч. 58, р.157 — 160. (54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК

ЧЕЛОВЕКА-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬHblX АНТИТЕЛ К D-АНТИГЕНУ СИСТЕМЫ

РЕЗУС Ч ЕЛ О В Е КА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения резус-принадлежности крови и для профилактики сенсибилиэации резус-отрицательных женщин при резус-несовместиИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения резус-принадлежности крови и для профилактики сенсибилизации резус-отрицательных женщин при резус-несовместимости беременности.

Цель изобретения — создание штамма культивируемых клеток человека, продуцирующих моноклональные антитела(Моп-AT) к 0-антигену системы резус человека.

Штамм культивируемых клеток получают следующим образом.

Лимфоциты периферической крови иммунного донора инкубируют с вирусом, затем культивируют в 96-ячеечных круглодонных платах по 30 тыс, клеток на ячейку с циклоспорином А для предотвраФ

„„SU,, 1678830 А1 (я)5 С 12 N 5/18, С 12 P 21/08 мой беременности. Целью изобретения является создание штамма культивируемых клеток человека, продуцирующих моноклональные антитела (Мон-AT) к 0-антигену системы резус человека. Линия получена в результате трансформации вирусом Эпштейна-Барр лимфоцитов периферической крови резус-отрицательного донора, иммунного против D-антигена. Штамм получил название 0-89/Н6 и депонирован под номером ВСКК(П) 390Д. Мон -АТ относятся к иммуноглобулинам класса G и в стандартных серологических тестах позволяют с высокой чувствительностью выявлять

0-антиген и его слабые формы (О"), что часто невозможно с помощью стандартных изоиммунных сывороток. Условия культивирования типичны для гибридов, титр Мон-АТ в культуральной жидкости составляет 1:4096.

2 табл. ол щения цитотоксического воздействия T-кле- 4 ток. Для получения линии наращивают клет- ©© ки из ячеек с максимальным ростом. и О;1 максимальным титром антител к 0-антиге- Я ну, способных выявлять также 0"-антиген. О

Штамм-продуцент получают в результате однократного клонирования линии методой

l лимитирующих разведений.

Штамм 0-89/Н6 депонирован под номером ВСКК(П)390Д во Всесоюзной коллекции клеточных культур и имеет следующие характеристики.

Морфологические признаки. Суспензионная культура состоит иэ клеток, собранных в шарообразные аггломераты.

Цитогенетические признаки. Нормальный кариотип человека, 46 ХХ, 1678830

Таблица 1

Антиглоб линовый тест

Желатиновая проба* *

Анти-анти гела

Титр

score

Моноклональные антитела

0-89/Н6

Поликлональная сыворотка с.13 с,16

Моноканальные реагенты:

Bloscot

1:256-1:512

1:32-1:64

1:64 — 1:128

44

1+

Не on е еляли

Культуральные свойства, Среда для культивирования RPMI 1640, с 10 (, эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ 1-глутамина, 2 Д НЕРЕЯ-буфера, антибиотики;

37 С, 5"-;ь СО2 в воздухе. Частота пассирования 3-4 сут, кратность рассева 1:2-1:3. Титр антител в культуральной жидкости, определяемой в прямой реакции агглютинации D+ эритроцитов, обработанных бромелином, составляет 1;4096.

Характеристика моноклональных антител. Моноклональные антитела, секретируемые штаммом D-89/Н6, выявляют . D-антиген эритроцитарной мембраны и его слабые формы (D); относятся к классу 6-иммуноглобулинов.

Способ криоконсервирования. Криозащитная среда: 50 Д ростовой среды, 40 сыворотки, 10 Д диметилсульфоксида, Клетки в криозащитной среде помещают на сутки при — 70 С, после чего переносят в жидкий азот, Жизнеспособность после размораживания 85 — 907ь; культивирование после размораживания в плотности

0,4 — 0,5х10 клеток/мл, Бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружены. Вирусы не тестированы.

Проводят сравнение активности моноклональных антител D-89/Н6 и поликлональных анти-D-антител в различных серологических тестах.

В табл. 1 приведены результаты сравнения моноклональных антител, секретируемых линией D-89/Н6, с отечественными поликлональными изоиммунными сыворотками и поликлональными типирующими реагентами и моноклональными препаратами зарубежного производства в непрямом антиглобулиновом тесте и конглютинации с желатиной со стандартными D + эритроцитами.

В табл, 2 приведены сравнительные результаты по выявлению слабых форм D-антигена (О") в непрямом антиглобулиновом тесте с анти-моноклональными антителами

D-89/Н6, стандартными поликлональными сыворотками отечественного происхожде5 ния и зарубежными коммерческими моно- и поликлональными реагентами.

Результаты. приведенные в табл. 1 и 2 показывают, что моноклональные антитела

D-89/Н6 как по титру, так и по авидности не

10 уступают или превосходят поликлональные отечественные и зарубежные сыворотки при выявлении нормально выраженного 0антигена и превосходят зарубежные коммерческие препараты при выявлении

15 D àíòèãåíà, Таким образом, на основе моноклональных антител, секретируемых штаммом

0-89/H6, возможно создание высокоактивного и высокоспецифичного анти-D-реаген20 та. Моноклональные антитела D-89/Н6 стабильны, их титр в препарате не снижается в процессе длительного хранения.

Применение моноклональных антител

D-89/Н6 приведет к значительному эконо25 мическому и социальному эффекту за счет отмены затрат на получение поликлональных изоммунных сывороток, снижения числа ошибок в трансфузионной практике.

Применение анти-0-моноклонального пре30 парата позволит осуществлять профилактику сенсибилизации резус-отрицательных женщин резус-положительными эритроцитами плода, что приведет к резкому снижению числа тяжелых гемолитических

35 осложнений и позволит предотвратить многочисленные случаи гемолитической болезни новорожденных.

Формула изобретения

40 Штамм культивируемых клеток человека ВСКК{П)-390 Д, — продуцент моноклональных антител к D"ýíòèråíó системы резус человека.

1678830

Продолжение табл.1

Желатиновая проба **

Антиглоб линовый тест

Анти-антела

Титр

score

109

124

1:1024

1:1024

Transclone

Bordeanx

* Титр антител определяли в непрямом антиглобулиновом тесте в 96-луночных микроплатах.

** Суммарный титр — score — является общепринятой характеристикой авидности антител и отражает выраженность реакции агглютинации, *** Оценка интенсивности реакции агглютинации: 3+ крупные агглютинаты, 2+ агглютинаты средних размеров, 1+ мелкие агглютинаты.

Табли а2

D-89/НЬ

32 53 16 75 64 41 16 20 32 38 32 12

ИКА Вогдеаих

10 64 41 8 17 16 23

Поликлональ ная сыворотка, с.16

8 20 4 12 16 32 4 6 4 Ь 8 S

Поликлональная сыворотка (Финляндия) 8 22

0 0

2S 0 0 2 4 0 0

Составитель А.Маныкин

Техред М. Моргентал Корректор И.Муска

Редактор Н.Яцола

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101

Заказ 3183 Тираж 363 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5