Штамм вируса иммунного дефицита человека для приготовления диагностических систем

 

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано для диагностики вируса иммунного дефицита человека (ВИЧ)-инфекции. Цель изобретения - получение высокопродуктивного штамма ВИЧ. Для этого из лимфоцитов периферической крови был выделен вирус иммунодефицита человека, который в процессе пассирования приобрел свойства, не обнаруженные ни у одного изолята в СССР. Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов под номером 878. ВИЧ - I Zmb оказался высокопродуктивным и имел инфекционный титр 10 , обладал выраженными синтицийобразующими свойствами в пермиссивных к ВИЧ культурам клетках. На основе выделенного штамма ВИЧ-1 Zmb были приготовлены диагностические системы, которые оказались высокоспецифичными и чувствительными . 1 табл. со с XI о со о со о

,-,I .: -Г :ИХ

Г.ПЦ.1Г ЛИСЯТ, СКИХ

РГ i!I с t лг

Is!Is С 12 N 7/00

I!rс, с ДД, Г IHE ННГ,;и K/I,1ИГГ1

Г)О l 1 S O b r Е С сЛ я Л И O I K I Ь Г И я Гсс!

ГТРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4807119/13 (22) 19.01,90 (46) 07.01.92. Бюл. № 1 (71) Белорусский научно-исследовательский инсгитут эпидемиологии и микробиологии (72) П.Г.Рытик, В Ф.Еремин Н.Д.Коломиец и С.А.Попов (53) 576.858 (088.8) (56) 1. Propovic М., Sargadharan M.G., Read Е., Gallo R,Е. Detection, isolation and continuous

prodaction of cytopathic retroviruses HTLVlll

from patient with AfDS and pre-AlDS. Science, 1984, v. 224, р. 497-500.

2. Barre-Sinooisi F., Cherman J.Ñ., Rey F

Isolation of а Т вЂ” limphotropic retrovirus es

from à patient at a risk for acquired immune

deficiency syndrome AIDS. Science.. 1983.

v 220, р. 868-871.

3. Koyanagi Y.. Harada S.. Takahashi М., Vchino F., Yamamoto N. Selective cytotoxity

of AIDS virus infection towards HTLV-l

transformed cell lines. lnt. J. Cancer,. 1985, ч. 36, р. 445 — 451.

4. Рытик П.Г.. В.Д.Гроен, Еремин В.Ф., Коломиец Н,Д., Попов С.А. Биологические свойства вируса иммунного дефицита, выделенного от жителя БССР. Здравоохранение Белоруссии. 1989, ¹ 1 1. с 1 1-12.

5. Березин В.3.. Зайдес В.М, Жданов В.M. Изучение условий эффективного связывания антител с белками вируса иммунодефицита человека в иммунаблоте. Вопросы вирусологии. — 1987. №. 4 с 432-437.

Изобретение относится к вирусологии и ложет быть использовано для диагностики вируса иммунного дефицита человека (ВИЧ)-инфекции.

ВИЧ вызывает тяжелое инфекционное заболевание. названное СПИД. Леталь, Ж«, 1703686 Al (54) ШТАММ ВИРУСА ИММУННОГОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ

ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СИСТЕМ (57) Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано для диагностики вируса иммунного дефицита человека (ВИЧ)-инфекции. Цель изобретения — получение высокопродуктивного штамма ВИЧ.

Для этого из лимфоцитов периферической крови был выделен вирус иммунодефицита человека, котОрый в процессе пассирования приобрел свойства, не обнаруженные ни у одного изолята в СССР. Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов под номером 878. ВИЧ вЂ” Zmb оказался высокопродуктивным и имел инфекционный титр

10, обладал выраженными синтицийобразующими свойствами в пермиссивных к

ВИЧ культурам клетках. На основе выделенного штамма ВИЧ-1 Zmb были приготовлены диагностические системы, которые оказались высокоспецифичными и чувствительными. 1 табл.

Ф ность при данной болезни достигает 6080%, а по некоторым данным и 100%. До настоящего времени нет эффективных средств лечения и профилактики ВИЧ-инфекции. В связи с этим перед здравоохранением стоит задача своевременного

1703686

55 выявления и изоляции вирусоносителей и больных СПИД.

Для диагностики ВИЧ-инфекции в лабораторных условиях используют методы

МФА, ИФА и иммуноблотинга, приготовленных на основе ВИЧ, выращенного в перевиваемых культурах лимфобластов.

Однако в настоящее время у нас в стране нет высокопродуктивного штамма ВИЧ, а для приготовления диагностических наборов используются вируссодержащие клеточные лизаты, полученные из-за рубежа.

Известны штаммы ВИЧ-1! IIB, LAV (1,2), которые используются для приготовления диагностических наборов, Инфекционные титры этих вирусов в культуральной среде колебались в пределах 10 5-10 6(3).

Недостаток — недостаточно высокая репродуктивность, Кроме того, их нельзя использовать для приготовления диагностических препаратов, так как в СССР использовать их в комерческих целях без покупки лицензии невозможно.

Прототипом является штамм ВИЧ-IZ(4), Титр данного вируса в культуральной среде равнялся 10 — 10, Вирус вызывал цитопатический эффект в культуре клеток.

Недостаток — недостаточно высокая репродуктивность.

Цель изобретения — получение высокопродуктивного штамма ВИЧ.

Поставленная цель достигается путем выделения вируса иэ лимфоцитов периферической крови вирусоносителей и последующей адаптацией инфекционного агента для роста на перевиваемых культурах лимфобластов с титром 10

Штамм ВИЧ-1 находится на депонировании в государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д,И.Ивановского AMH СССР.

Получение штамма, Лимфоциты периферической крови выделяли в градиенте верографина, стимулировали фитогемагглютинином (10 мкг/мл) и культивировали затем в ростовой среде

RPMI — 1640 (производства Института полиомиелита АМН СССР), содержащей на

100 мл;10 эмбриональной телячьей сыворотки, 10мМ НЕРЕЯ, 14 мкг гентамицина, 0,03;ь глютамина, в течение двух недель, На протяжении указанного времени культуру лимфоцитов дважды подкармливали донорскими лимфоцитами из пупочной вены.

После двух недель культивирования лимфоциты проверяли на наличие антигенов

ВИЧ и проводили кокультивирование их с перевиваемыми культурами клеток пермиссивными к ВИЧ в соотношении 1:5. С увеличением числа пассажей титр вирусных

50 антигенов увеличивался и к 10-15 пассажам достигал максимального значения 10 . К настоящему времени проведено 24 пассажа

ВИЧ на перевиваемых культурах лимфсцитов. Наличие вирусных антигенов в культуральной среде определяли с помощью метода ИФА в системах "Abbot" и "Вектор", в концентрате вируссодержащей культуральной жидкости определяли обратнотранскриптазную активность.

Морфология ВИЧ-I Zmb, Морфологические исследования не выявили отличий в структуре ВИЧ-I Zmb no сравнению с известными штаммами.

Свойства штамма.

В течение 1-5 пассажей вирус определялся в культуральной среде в титрах 10

10 (методом предельных разведений) и вызывал цитопатический эффект в культуре клеток MT-4, С пассажами титр вируса повышался и к 15 пассажу составил 10, Вирус вызывал цитопатический эффект(ЦПЭ) и образование синтициев в клетках MT-4, Н-9, СЕМ SS u Jurkatt на 1-2 сутки после заражения.

Характер роста штамма.

Штамм ВИЧ-1 Zmb выращивали в перевиваемых культурах клеток, чувствительных к вирусу: МТ-4, Н-9, СЕМ SS, Jurkat, Molt.

4/8. Пассирование проводили на 7 сутки в соотношении 1;5, Пример 1, Культивирование и титрование вируса, Вирус выделяют из лимфоцитов периферической крови носителей, адаптируют для роста на перевиваемых культурах лимфоцитов. Культивирование проводят на клетках МТ-4, Н-9, СЕМ SS, Molt 4/8 в среде RPMI-1640, содержащей 10;ь ЭТС, 0,01М HEPES, 0,3;ь I -глютамина, 6 мкгlмл гентамицина. Подкормку клетками и пассирование проводят на 7 сутки. Титрование вируса регистрируют с помощью метода флюоресцирующих антител и визуально по цитопатическому эффекту.

Пример 2, Приготовление диагностических препаратов, Суспензию вируссодержащих клеток в количестве 10 на 1 мл отмывают фосфатным буфером (рН 7,2) и наносят автоматической пипеткой на стекла в виде капель по 15 мкл. Препарат высушивают на воздухе и фиксируют в холодном ацетоне (-20 С) 10-20 мин. После фиксации препараты подсушивают на воздухе и используют для постановки реакции, либо хранят при 20 С.

Вирус осаждают ультрацентрифугированием при 30000 об/мин 1 ч (ротор Ti 45

Весгпап), ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере (0,01 М рН 7,2), наслаивают на двухступенчатый градиент урографина (151703686

Исследуемые сывооотки

Положительные

Ложноположительные

Отри цател ьн ые

МФА—

ИБ—

20

Составитель В. Еремин

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Т. Малец

Редактор Л. Волкова

Заказ 40 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва. Ж-35, Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101

50% обьемl объем). Центрифугирование проводят 2 ч при 24000 об/мин в роторе SW

27 (Вестап). Затем вирус осторожно собирают пипеткой и осаждают в роторе Ti 65 при 30000 об/мин 1 ч и ресуспендируют в солевом фосфатном буфере (рН 7,2). Концентрат вируса или вируссодержащий клеточный лизат наносят на 12 ДСН-НААГ.

Электрофорез проводят в течение ночи при

7-8 мА. Перенос белков с геля на нитроцеллюлоэную мембрану проводят по известной методике (5), О качестве переноса судят по окраске мембраны после 27ь-ным раствором амидочерного. После отмывки фильтров их используют в работе, оставшиеся хранят при — 20 С до использования.

Результаты исследования сывороток крови от вирусоносителей, доноров и ложноположительных с помощью методов МФА и иммуноблотинга, проведенных с исполь5 эованием предлагаемого штамма, представлены в таблице.

Результаты исследований показывают. что получено 100 g, совпадение результатов при использовании обоих методов.

10 Таким образом, впервые получен штамм ВИЧ-1с такой высокой репродуктивной способностью (10 ).

Формула изобретения

Штамм вируса иммунного дефицита че15 ловека ГКВ-878для приготовления диагностических систем.