Способ получения ротавирусных антигенов
Изобретение относится к медицинской ч ветеринарной BHpvconorHH, в частности к технологии получения антигенных препаратов, Цель изобретения - повышение выхода биомассы ро- (Тавирусных антигенов. Это достигается предварительной обработкой культуры клеток гидрокортизоном в количестве 0,03-0,07 мг/мл за 24 ч до заражения, а затем внесением вируса и после завершения его репродукции очисткой и концентрированием антигенов адсорбцией ча частипах сорбента - аминоэтоксиазросила при кислых значениях рН 4,0-5,0 и элюпией при щелочных значениях рН 8,2. 12 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
А1
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ по изоБРетениям и отнРытиям
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ «ЕНИЯ
= "1 -Я1Я 1О ТЕМ (21) 4678836/13 (22) ?3.01.89 (46) 23.12,91. Бюл. ¹ 47 (71) Киевский государственный институт усовершенствования врачей
МЗ СССР (72) В.Н.Гирин, И.И.Бойко, И.В.Дзюблик и В.II,Плугатырь (53) 576,8.097(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР
¹ 789115, кл. А 61 К 39/225, А 61 В 10/00, 1980. (54) СПОСОБ ПОЦУЧЕНИЯ РОТАВИРУС(ЫХ
АНТИГЕНОВ (57) Изобретение относится к медицинИзобретение о. носится к медицинской и ветеринарной вирусологии, в частности к технологии получения антнгенных препаратов. .Цель изобретения — повышение выхода биомассы ротавирусных антигенов.
Способ осуществляют следующим образом. В культуру клеток человека или, животных, предварительно обработанную гидрокортиэоном в дозе 0,03-0,07 мг/мл среды в течение 24 ч, вносят ротавирус в заражающей дозе 0,35 ЩЛ<гял и инкубируют в термостате для накопления биомассы ротавируса в течение
48 ч. Затеи клетки вместе с культу ральной средой трижды эамораживают и оттаивают, клеточный детрит осаждают центрифугированиегя, вируссодержащую надосадочную жидкость обрабатывают 1М НС1 до рН 4,0-5,0. В подкисленную надосадочную вируссодержащую
„,SU„„) 7ооо54 (51) 5 С 12 N 7/00 А 61 К 39/00
2 ской и ветеринарной вирусологии, в частности к технологии получения антигенных препаратов. Цель изобретения — повышение выхода биомассы ро;тавирусных антигенов, Это достигается предварительнn÷ обработкой культуры клеток гяядрокор:иязоном в количестве
0,03-0,07 мг/мл эа 24 ч до заражения, а эатегя внесением вируса и после завершения eãо репродукции очисткой н концентрированием антигенов адсорбпией на частит ах сообента — амияоэтокснаэроси. а при кислых значениях рН 4,0-5 0 и элюпией при щелочных значениях рН = 8,2. 12 табл.
С:
;я=дикость вносят 175 :гg ë аминоэтоксиаэросила для адсорбции ротавирусных ант:ягенов, встр-iхивают 5 мин, центриАугируют при 2 тыс. об/мин — 15 мин, после чего надо адок, уже не содержащий ротавируснь.х антигенов, удаля- 1,,я ют. К осадку, представляющему собой вирусный антиген, сорбированный частицам- аминоэтоксиаэросила добав- д ,ляют для эяпоции 0,05!. трис-буйер д (pH 8,2) в количестве 1Е по отношению к исходному объему жидкости, встряхивают и освобождают от аминоэтоксиаэросила центряяяяяугированием при .. тыс. об/мнн — 15 минут, надоса-,фь док — готовый продукт, 3
П р и и е р !, Получение антиге-яов ротавируса обезьян SA-11.
Fo в -r-.eel клеток перевиваемой липни почки свиньи СПЗВ в питательной среде (45X среды 199,45К среды Игла
1700054 и 107. сыворотки к1)уппого рогатого сКОта) при посевной концентрации клеток
150 тыс/ил вносят 0,03 мг /мл гидрокортизопа, а при посевиo!» концентрации 200 тыс. кл./мл — 0,07 мг/мл.
Дозы г3(3(1)02(ортизо»»а I. B))(e 0,03 мг/мл недостаточно э()()фe!IT!(BI!I.I, а выше
О. О/ м! /мл принo;(s!T 3((! Iieтению реГц)адg:кш(и ро тапи()усов в:(летОчных 10 культура с (см. Табл. 1) . Обработанную ных шеикерах,, 1 oc3:.е чего повторно центр "(фу»ч»1) ую гри - ("»с- ° об/мин в Ге 35 чепие 15 мин. Надосадок удаляют и эл:опруют ротавирусные антигены О, 5И трио буфером (рП Л, .2) B ooúeì, состав3(я»ощии I % oт исхОдного .
Э «IIIepи;(е(»та3»ь((3;:е данные по влияни(о рН реакционной среды на адсорбцию рота)зир;-са о без ян НЛ-. 1 1 представлены в табл. 2. Установле((0,, что 93,8% ротавируса а, „cop,)è )óe -ся на частицах а(:иназ Гаксиазрос»(ла 1(р»» I(I»cJ!Bix значениях р.1 (4,0- 5,0) .
Да ..ные по 3»з.)=»Е(31! о З; )О)ЕКТИВ»(ОСти
BI!I()I 0 амина э Гак Jiiaopоc1»;(а 32 зйвиси IocTII от pFI элюирующего раствора представле 5 кы в табл, 3, (1аивысшей элюиру(ощей ,:.по" oбнО -.Т3»ю О())-:.(,()а(.Г О р 05 1 l трисбуфер -" р) I 0j)aH: .(те3(ь(11>! да((!»ь!е:; показ((ва(о 1(»»е -,р -.: Iy((!ecтна предложи(нного спасо- > ба по сравпенио с прототипом на эта-пах о-;I»c Tê!» и кон((еi(Tp!»puBa рога.ви»)ус» (;безь (1! НА-11 по таким харакT еристикам к .;с об:ем., (.о;(ержание белвзвесь клеток раз3(и)»а(от и выращива(от »2 О Бра Цаю(1»ихс Я бут ылЯ х B y стр Ойс тве дХ(я ра) Пг(e!) I .О О ((" J(I-.Т(П""2)(JHHÍ»(ÿ, 1 а (I(2)op (IIo0BaBII33лц(-Я -.; ет)е з 24 )(мана(.лой ПРЕ3(В-.I?II I (.)!1 1»0 «Шн (ТЫй OT I20I)oтки ра(.твopo! I Эр3)а (рН 7, C)), наИОсят po Гав»»1)ус oб. з: Я((SA 1 1 B дОзе 0,.25 ХЦД(,-„/ (сл. 3;-:. Гем через 1 ч Э ".. D адсорбцпп B!ij)yc(: на клетках ири 37 С 20 бутыли з(33(3 ва!."т подде1)жива(ощей средой сле,(у(()(;eBО саста»за-; 507, среды 199.,507 среды И» ла. 1 мкг/м3(трипсина. Па слс - д() с т»03(сии)(макс»») ()Йль 3»ОГО цитопа:1 (г-.еск()го э(ь)()екта через 48 ч 25 ,":-ггыли и((то((с»п)1 о ьстряхива)от и пере220ДЯ! М(Е (3;и 0 ь за(ЗСЬ ) KO(OP))IO ТГИж ды замор;. п(32а(от и оттаива(от, клеточные обломки уда)(Я;)т цс)(три(()угированием при 2 -Гыс. с ()/(и! -- 15 мин. Нацосадок ц сгб(»1)аю(q п01(к» лл1от II 1(С1 ДО рН 4, 05, 0 . В и О с Я т 1 / 5 их- / 3 (а.(1И н 0 з Г 0 к с иа э р 0сила., встряхива)от 5 мин на лаборатop-ка, титр в РНГЛ антигена и выход конечного продукта, представлены в табл. 4,. Пример ?. Получение антигенов ротавир тса свиней, штамм "К". Ro взвесь клеток перевиваемой линии почки свиньи СПЭВ в питательной среде (45% среды 199,45% среды Игла и 10% сыворотки крупного рогатого скота) при посевной концентрации клеток 150 TI!c/мл вносят 0,03 мг/мл гидрокортизона, а при посевной кон— центрацг(и ?00 тыс.»(JI/мл — 0,07 мг/мл. Дозы гидрокортизона ниже О, 03 мг/мл недоста Гачно эффективны.„ а выше 0,07 мг/мл приводят к угнетению репродукции ротавирусов в клеточных культурах. Данные по подбору опти-мальной дозы гидрокортизона приведе— ны н табл. 5. Обработанную взвесь клеток разливают и выращивают во вращающихся бутылях B устройстве для роллерного культивирования. На САормировавшийся через ?4 ч монослой клеток, предварительно отмытый от сыворотки раствором Эрла (рН 7,б), наносят ротавирус свиней, штамм "1(" в до;зе 0,25 ТЦД „ /кл. Затем через 1 ч адсорбцин вируса на клетках при 37 С бутыли заливают !Io I,((cpm(Ban!(!eA ср едой следу(о(;его состава: 5А% среды 199,50% а среды Игла, " мкг/мл трипсина После достижения максимального цитопатического эо)(»)екта через 48 ч бутыли интенсивно BcTpII)5»Ba!0T и пере— водят клетки во взвесь, которую трижды замораживают и оттаива(от, клеточные обломки удаляют центрифугировани-, ем при 2 тыс, об/мин — 15 мин. Надосадок отбирают, подкисляют 11» НС1 до рН 4,0-5,0, вносят 175 ь(г/л аминоэтоксиа оросила, встряхивают 5 мин на лабора "орных шейкерах, после чего повторно центрифугируют iip!I 2 тыс. об/мин — 15 мин. Надосадок у!»аляют и э3поиру»от ротавирусные антигень) 0,511 трис-буфером (рН 8,2) в объем, сî0ñс òTàaâB3ë»)ÿ»iþ0(ù(»èHé 1% от исходного . Экспериментальные данпь(с I о влиянию рН реакционной cpe3)II IIB адсорбцию ротавируса свиней, штамм K" представле п,(в табл. 6 . Устаповлено, чта 93,87, ротавируса свиней, штамм "К адсорбируется на частицах аминоэтаксиаэросила при кислых значениях рН (4,0-5„0). Данные по э(()*екти)(ности элюции рставируса свиней, штамм ) К(с амино1700054 0,0r 0„02 О.О: 0,О5 0,06 ), 07 0, ОЙ 0,1 3,5 6,3 7,0 7,0 7,0 6,0 1,0 этоксиаэроси..=i . .;:- .висимости от оН элюирующего раствора представлены табл ° 7. Наивысшей элюирующей сггособностью обладает 0,05Р тряс-буфер с рН 8,?.. Сравнительные данные, показывающие преимущества предложенного способа по сравнению с известным на этапах очистки и концентрирования ротавируса 10 свиней, штамм "K" по таким характеристикам, как объем, содержание белка, титр в PHIA антигена и выход конечного продукта, представлены в табл.8. Пример 3. Получение антигенов 15 ротавирусов свиней, штамм "T". Во взвесь клеток перевиваемой линии почки свиньи СПЭВ в питательной среде (45.. среды 199,45 среды Игла и 10? сыворотки крупного рогатого ско 20 та) при посевной концентрации клеток 150 тыс.кл/мл вносят О,ОЗ Mr/mr гидро:кортизона, а при посевной концентрации 200 тыс.кл/мл — 0,07 мг/мл. Jlîçû гицрокортизона ниже 0,03 кг/мл недо статочно эффективны, а выше 0,07 мг/мл приводят к угнетению репродукции ро— тавирусов в клеточных культурах. Данные по подбору оптимальной дозы гидрокортизона приведены в табл. 9. 30 Обработанную взвесь клеток разливают и выращивают во вращающихся бутылях в устройстве для роллерного культивирования. На сформировавшийся через 24 ч монослой клеток, предварительно отмытый от сыворотки раствором Эрла (рН 7,6), наносят ротавирус свиней, штамм "T" в дозе Э,25TIVI;>>/кл. Затем через 1 ч адсорбции вируса на щ клетках при 37 С бутыли заливают под— о держивающей средой следующего состава: 507 срецы 199,50Е среды Игла, 1 мкг/мл трипсина. После достижения максимального цитопатического эффекта, через 48 ч бутыли интенсивно встряхивают и переводят клетки во взвесь, которую трижды замораживают и оттаивают, клеточные обломки удаляют центрифугированием при ? тыс, об./мин — 15 мин. Надосадок отбирают, подкисляют 1И НС1 до рН 4,0-5,0, вносят 175 мг/л амино— этоксиаэросила, встряхивают 5 мин на лабораторных шейкерах, после чего по-. вторно центрифугируют при 2 тыс. об/мин — 15 мин. Надосадок удаляют и элюируют ротавирусные антигены 0,51 трис-буфером (рН 8,2) в объем, сос— тагляющий 17 от исходного. Экспериментальные данные по влиянию рН реакционноч среды на адсорбцию ротавируса свиней, штамм "Т". представлены в табл. 10. установлено, что 92? ротавируса свиней, штамм "Т", адсорбируется на частицах аминоэтоксиаэросила при кислых значениях рН (4,0 — 5,0) . Данные по эффективности элюции ротавируса свиней, штамм "Т" с аминоэтоксиаэросила и зависимости от рН элюирующего раствора представлены в табл. 11. Наивысшей элюирующей способностью обладае= 0 )5N трис-буфер с рН 8,?. Сравнительные данные, показывающие преимущества предложенного способа по сравне1лию с изв cтным на эгапах очистки и концентрирования ротавируса свиней, штамм Т по таким характеристикам как объем, содержание белка, титр в ГИГА антигена и выход конечного продукта, представлены в табл.12. о р и у л а и з о 6 р е т ения Способ получения ротавирусных антигенов, включаю:шлйл выращивание ротавирусов в клеточных культурах, их выделение из ин пщированных клеток с последующей очисткой и концентрированием:, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта В средъ добавляют гидрокортизон в количестве "i,03-0,07 мг/мл ь за 24 ч .до заражения клеточной культуры, а очистку .:-: концентрирование осуществляют адсорбцией ротавирусного антигена Hp- сорбенте при кислых значениях рП 4,0 — 5,0 с п.следующей элюцией при щелочных значениях рН 8,? . Та блица 1 Влияние доз гIfäðîêîðòèýîíà па ин- " фекционныч титр ротавируса обезъян Доза ги.—, рокорти.-.n- Инфекционный титр «.на, мг/мл 1ротавируса обе:-.ьян ! ЯА — 11. 1.,; Т Г /мл 1700054 Та блица Влияние р11 1эеакционной среды на адсорбцию ротавируса обезьян Процент адсорбированного ротавируса обезьян SA — 11, % рН реакционной ср еды Т а б л и ц а 3 Эффективность элюции ротавируса обезьян с аминоэтоксиаэросила в зависимости от рН э.пюирующего раствора Элюирующая система рН элюирую 1ей Титр ротасистемы вируса SA-11 в РНГА ф п/и 5120 7,2 8,0 8,2 9,3 1. 2. 3. Та блица 4 Сравнительные характеристики биомассы продукта Антиген- Удельная ная ак- антиген-. Объем, мл Ис следуежп материал Способ Степень конце нт Содержание белрирования, 7 исход- конный центка по Лоури, мг/мл тивность ная активтитр в ность, PHГА ед/мг м-л рат Ротавирус обезьян SA-1 1 Способ получения анти1:640 68,8 9,3 100 5 Ротавирус обезьян SA-11 Способ получения рота1:20480 11252 100 100 1 1,82 гена для диагностики вирусного гастроэнтерита (по известному способу) вирусных антигенов (по предлагаемому способу) 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 7,0 8,0 Раствор Эрла Дистиллированная вода 0,05И трис-буфер 0,05И трис-буфер 75,0 93,8 93,8 93,8 87,5 87 0 75," 75,0 1 7 )0054 Продолжение табл.6 Та блица 5 Влияние доз гидрокортизона на инфекционный титр ротавируса свиней Доза гидрокортизона, мг/мл Та блица 7 Эффективность элюции ротавируса свиней с аминоэтоксиаэросила в зависимости AT рН элюируюшегo раствора Титр ротавирН элюир уюшей сист емы Злюир уюшая система zo -" " руса свиней, штамм К в Р11ГА Та бли ца 6 Влияние рН реализационной среды на адсорбцию ротавируса свиней 25 1. 2. рН реакционной среды Процент адсорбирован— ного ротавируса сви— ней, штамм "К", % 2560 7 2 1280 8,0 20480 8,2 4, 3,5 4,0 75,0, 93,.8 51? 0 Таблица8. Сравнительные характеристики биомассы продук та Т мл Лнтиген- Удельная Исследуемый материал Способ Объем, Степень Содержание белконцентриная ак- антигенная исходный концентрат ка по Лоури, и\ /, ÿ тнв HOCTb активность, ед /мг рова" ния, Х титр в РНРА Способ по- Ротавирус лучения свиней, антигена штамм "К" 100 . 5 1:640 75,2 для диагностики вирусного гастроэнтерита {по известному способу) 0,01 0,02 0,03 0,05 0,06 0,07 0,08 0,10 Инфекционный титр ротавируса свиней, штамм "К", 1.р Т1Д,)/мл 3,5 5,0 6,3 7,0 7,0 7,0 6,0 1,0 4,5 5,0 5,5 6, ) 7,0 8,0 Раствор Эрла Дистиллированная вода 0,0511 трис— буфер 0,0511 трисбуД>ер 93,8 93,8 87,5 87,0 75,0 75,0 1700054 сследуемый материал Способ Степень конОбъем, мл Антигенная акСодержание белУдельная антигенная центрирования, Ж исход — концентный рат ка по Лоури, мг/мл активность, ед/мг тивность титр в РНГА м-л Рот авирус Способ пслуч ения ротави1:20480 10779 100 русных антиге нов (по прецлагаемому способу) Та блица 9 Влияние дo3 гицрокортизона на ин.фекционный титр ротавируса свиней Доза гидр окортив эона, мг/мл Инфекционный титр ротавируса свиней, штамм "Т 18 Те о/мл Та блица 11 Эфектинность элюции ротавируса свиней с аминоэтоксиаэросила в зависимости от рН элюирующего раствора Титр ротавируса свиней, штамм "Т" в РНГА рН элюиРующей системы Элк ир ующая система Р п/и Таблица t0 Влияние рН реакционной среды на адсорбцию ротавHpуса cBиней Раствор Эрла 7,2 Дис.тиллировакная вода 8,0 0,05M трисбуфер 8,2 0905И трисбуфер 9,3 1280 рН оеакциош|ой среды 640 3. 51 20 2660 3 5 4,0 73 0,01 0,02 0,03 0,05 0906 0,07 0,08 0,1 I свинеи 9 штамм "1<" 100 1 1,5 3,0 4,3 5,0 5,0 5,1 4,0 0,5 Процент адсорбирован— ного ротавируса свиней, 111тамм 11Т11 4,5 5,0 5,5 6,0 7,0 8,0 Продолжение табл,8 Продолжение табл.10 92 92 87 87 73 1 700054 Та блица 12 .Сравнительные характеристики биомассы продукта Объем, мл Исследуемый материал Способ Степень концентриСодержание белАнтигенная актив ность Удельная антигенная исходный концентка по Лоури, мг/мл активность, ед/мг рат р онания % титр в РИГА м-л Способ по- Ротавирус лучения ан- свиней, тигена для штАмм "Т" диагностики вирусного гастроэнтерита (по известно20 5,5 1:320 58, 100 5 му способу) P отавирус свиней, штамм ™Т" 100 1 Способ по1:5120 4266,6 100 Редактор Н.Козлова Заказ 4443 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 луч ения антиген (по предлагаемому способу) Составитель С.Пылоза Техред Л.Сердюкова Корректор А,Обручар