Способ выделения иммуноглобулина g из сыворотки крови кур

 

Изобретение относится к технологии получения иммуноглобулина класса G. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта и его антительной активности Поставленная цель достигается тем, что для получения иммуноглобулина класса G осаждение иммуноглобулинов ПЭГом - 6000 проводят дважды, первый раз при концентрации ПЭГ 13%, а второй раз при концентрации ПЭГ 10%. рН 44-46 с последующим подтитровыванием насадка до рН 5,6-5,8 1 табл СО

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

<я> s А 61 К 39/395

ГОСУДАРСТВЕН 1ЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4705742/13 (22) 18.04.89 (46) 07.12.91. Бюл, Q 45 (71) Всесоюзный научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства (72) Э.Д,Джавадов, Е.H.Ãoðáa÷åâ и И.МДжавадова (53) 547.962.4(088.8) (56) Campfeil D,H. et а1. Methods in Immunology. — New Jork, 1970, р.189-191.

SrvarIl F. Fragner l.//l. of. hygiene epldemlol., mikro6lol, and immunol. 1965, ч.9, р, 459-467, Пономарев Н.А., Нечаева А.С. Гамма-глобулин. — M.: 1965, с.65 — 83, Poison А, et а1 //Blochem. Blophys. acta.

1964, ч,82, р.463 — 467.

Flodin P., KiIlander 1.//Blochem. Blophys, acta, 1962, ч,63, р.403-410.

Иммунологические методы, /Под ред, Г.Фримеля, — М.: Медицина, 1987, с.390396.

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к иммунохимии птиц, и может быть использовано в сывороточном производстве для выделения высокоактивного специфического имМуноглобулина класса G (IgG) из сыворотки крови кур с целью дальнейшего его использования в иимунохимических методах.

Известны способы выделения IgG из сывороток крови животных: высаливание сульфатом, риваноловый способ, осаждение этанолом, осаждение попиэтиленгликолем (ПЭГ) и гель-фильтрация. Однако эти способы характеризуются рядом недостатков: боль- шими потерями IgG при очистке (хроматография), наличием примесных белков

„„5U„„1695931 А1 (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНА G ИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ

КУР (57) Изобретение относится к технологии получения иммуноглобулина класса

G. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта и его антительной активности. Поставленная цель достигается тем, что для получения иммуноглобулина класса G осаждение иммуноглобулинов ПЭГом — 6000 проводят дважды, первый раз при концентрации ПЭГ 13%, а второй раз при концентрации ПЭГ 10%, рН 4,4 — 4,6 с последующим подтитровыванием насадка до рН 5,6 — 5,8. 1 табл. (осаждение этанолом, высаливание сульфатом аммония, риваноловый способ, гельфильтрация); значительным снижением антительной активности выделенного по сравнению с исходным материалом (хроматография, осаждение этанопом): трудоемкостью и низкой производительностью (хроматография, риваноловый способ).

Прототипом является способ выделения иммуноглобулина класса G из сыворотки крови кур. предусматривающий фракционное осаждение глобупинов сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией. Однако способ многостадиен, малопроизводитепеп н сопровождается значитепьными пптерчми

1695931 ной хроматографией на колонке с

ДЭАЭ-целлюлозой, гель-фильтрацией на сефадексе G-200, высаливанием сульфатом аммония, риваноловым способом и осаждением этанолом.

Для проведения опытов-берут гипериммунную куриную сыворотку к вирусу болезни Гамборо. Иммуноглобулины выделяли из 10 мл гипериммуннай куриной сыворотки, а объем выделенного иммуноглобулина доводили до 5 мл.

Чистоту выделенных иммуноглобулинов контролировали в иммунозлектрофоре50 белка и снижением антительной активноCTN.

Цель изобретения — повышение выхода иммуноглобулина класса 6 из сыворотки крови кур и его антительной активности. 5

Поставленная цель достигается тем, что, для получения иммуноглобулина класса

G, осажден ие иммуноглобул иное П Э Гом6000 проводят дважды, первый раз при кон. центрации 13, а второй раз при 10 . ;концентрации ПЭГа-6000 10 при рН 4,4 4,6 с последующим подтитровыванием надосадка до рН б,6 — 5,8.

Пример 1. На первом этапе сыворотку крови кур разводят 1:1 (по объему) 0,05 М 15 фосфатно-солевым буфером(Ф „Б) с рН 7,88,0и инкубируют16 — 18ч при 4-6 С. Осадок. удаляют центрифугированием при 5000 об./мин в течение 30 мин. К полученному надосадку капельно при постоянном поме- 20 шивании на холоде добавляют 50 -ный (вес/объем) раствор ПЭГа-6000 до конечной концентрации в растворе 13%. Смесь инкубируют 1,5 — 2,0 ч при 4-6"С. После этого : раствор центрифугируют при 5000 об./мин 25 в течение 30 мин. Супернатант сливают, а осадок ресуспендируют 0,05 M натрийацетатным буфером с рН 4,4 — 4,6 до объема, равного двум обьемам сыворотки, Затем капельно, при постоянном помешивании, до- 30 бавляют 50%-ный раствор ПЭГа-6000 до конечной концентрации в растворе 10%.

Полученную смесь инкубируют 1,5-2,0 ч при

4 — 6 С. Раствор центрифугируют при 5000 об./мин в течение 30 мин. Супернатант сли- 35 вают в отдельную посуду и подтитровывают

1 N раствором NaOH до рН 5,6 — 5,8, Раствор инкубируют 1,5 — 2,0 ч при 4-6 С. После этого раствор центрифугируют при 5000 об./мин в течение 40 мин. Осадок растворя- 40 ют в минимальном объеме 0,01 M ФСБ рН

7,2 — 7,4 и диализуют против 200-кратного объема этого же буфера в течение 48 ч при

4 — 60 С

Выделение иммуноглобулина класса G 45 проводят описанным способом. Параллельно!96 выделяют ПЭГом-6000, ионнообмензе с кроличьей антикуриной сывороткой.

Иммуноглобулины, выделенные двукратным осаждением ПЭГом-6000 с последующим подтитровыванием, ионнообменной хроматографией и этанолом, образовали одну линию преципитации, соответствующую фракции lgG. Иммуноглобулины, выде-, ленные другими способами, образовывали две и более линий преципитации, что свидетельствует о наличии примесных белков, Наивысший выход белка (9,82 ) установлен при выделении иммуноглобулинов высаливанием сульфатом аммония. Однако это обусловлено наличием в выделенной фракции иммуноглобулинов примесных белков, Наимейьший выход белка (5,71%) отмечен в ионнообменной хроматографии (таблица). Это обусловлено потерями иммуноглобулина.

Чистоту выделенных фракций IgG конт-ролировали в иммунозлектрофорезе и препаративном электрофорезе в полиакриламидном геле (ПААГ). На иммуноэлектрофореграмме видна одна полоса преципитации, соответствующая фракции IgG кур. Столбик ПААГ после электрофореза окрашен в зоне фракции IgG.

Специфическую активность выделенных иммуноглобулинов определяли в реакции диффузной преципитации (РДП) и в

ИФА. Титр иммуноглобулинов, выделенных различными способами, колебался от 1;64 до 1:256 (таблица). С целью обьективной оценки чистоты выделенного IgG и сохранения его антительной активности определяли удельную активность (титр 1 мг белка) в РДП и ИФА, Наивысшую удельную активность имели иммуноглобулины, выделенные двукратным осаждением ПЭГом-6000, причем активность их превышала в 2-4 раза титр иммуноглобулинов, выделенных другими способами.

В дальнейшем, иммуноглобулины, выделенные из иммунной сыворотки к вирусу болезни Гамборо, использовали для получения иммунопероксидазных коньюгатов с последующим применением в ИФА для индикации антигена вируса болезни Гамборо, При этом наивысшую активность имел конъюгат пероксидазы с IgG, выделенный двукратным осаждением ПЭГом-6000. Результаты описанных данных представлены в таблице, Приведенные данные свидетельствуют о том, что двукратное осаждение ПЭГом6000 с последующим подтитровыванием надосадка до рН 5,6-5,8 пригодно для выделения иммуноглобулинов класса G из сыворотки крови кур.

1695931

Предлагаемый способ дает возможность увеличить выход иммуноглобулинов класса G со значительной степенью очистки при наименьших потерях с сохранением антительной активности выделенных !9G.

Формула изобретения

Способ выделения иммуноглобулина 6 из сыворотки крови кур, включающий кратную обработку сыворотки осаждающим агентом в понижающейся концентрации, отделение осадка, растворение его в буферном растворе и очистку осадка, содержащего целевой продукт, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целеспособ выделения су, мг/мл Выход титр в Удельный Активность титр в ифА Удельвйя иммуноглобулина белка, Х РДП титр в Р)>» конъигата титр в ИФА

7,68 1 >-256 29>8

1:8192

1:4096

1:4096

8,6

952

1:800

64О

525

5,71 1:64 10>0

6,96 1: 128 16,4

1 200

1:400

6,4

7,8

9,82 1: 128 11,6

8 66 1: 128 13 2

8,48 1:64 6>7

1:8192

1: 4096

1: 2048

422

215

1: 400

1: 400

1: 100

1:4096

413

8,89 1: 128 12,9

1: 400

1:64

Составитель Д.Папковский

Техред М.Моргентал Корректор Н.Король

Редактор Н.Яцола

Заказ 4249 Тираж, Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул. Гагарина, 101

Осавдение ПЭГом6000 Ионообменная хроматография

Гель-фильтрация

Высаливание сульфатом аммония »,0

Риваноловый способ 9,7

Осавдение этанолом 9>5

Осандение ПЭГом6000 (прототип) 9,9

Исходная сыворот ка 56,0 вого продукта и его антительной активности, обработку проводят двукратно. в каче. стве осаждающего агента используют полиэтиленгликоль мол,м. 6000, при этом

5 при первой обработке полиэтиленгликоль вводят до конечной концентрации 13 мас. $ на обьем раствора, полученный осадок растворяют при рн 4,4-4,6, повторно обрабатывают полиэтиленгликолем при конечной

10 концентрации 10 мас.$ на объем раствора, отделяют жидкую фазу, доводят рН ее до

5 6- 58 и отделает осадок. содержащий целевой продукт.