Способ культивирования вируса лейкоза крупного рогатого скота

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и клеточной биотехнологии . Конкретно к способу культивирования вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), который может быть использован и приготовлении иммунодиагностических и иммунопрофилак-. тических средств, а такгсе при проведении разного рода вирусологических и молекулярно-иммунологических исследований . Цель изобретения - увеличение репродукции ВЛКРС. Для этого в культуралъную среду, содержащую среду Игла с 10% сыворотки крупного рогатого схота вводят 596-диметилбензимицазолил-Сс-метилкобамидк- (метилкобаламин) в концентрации от 0,074-10 до 2, что позволяет увеличить репродукцию вируса лейкоза на 30-50%. 1 та бл. -,-е о «

СОЮЗ СОВЕТСкичл

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

«в -@«

<(g1t)< 0 12 N 5./00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ П НТ ССССО (21) 4811056/13 (22) 23.02.90 (46) 23.12.91. Б><>л, 1,"- 47 (71) Институт биохимии ЛитАН (72) 10.А,Рачкус, Д.-И.13,Адомайтене и С,И.Канопкайте (53) 578,085,23(088.8) (56) Методы культивирования клеток„

Л., Наука, 1988, с. 47-62, Интеграционные нирусы, Рига, Зинатне, 1985, с. 44 — 49, (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВА1КЯ ВИРУСА

ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (57) Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и клеточной био-технологии. Конкретно ic способу кульИзобретение относится к ветеринар-ной вирусологии и клеточной биотехнологии, в частности к способу культи-варования вируса лейкоза крупного рогатого скота {ВЛКРС1, который может быть использован в приготовлении иммунодиагностических и иммунопрофилактических средстн, а также при проведении разного характера нирусологических и молекулярно-иммунологич<еских исследований.

Цель изобретения — увеличение репродукции вируса лейкоза крупного рогатого скота., 1ля этого при осуществлении способа репродукции вируса лейкоза в клеточной культуре к питательной среде

Игла, содерж;пней 10 . сьпзоротки крупного рогатого с«< та „д<><авля«>т 5,6-дитивирования вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), который может быть использован в приготовлении иммунодиагностических и иммунопрод>илактических средств, а также при проведении разного рода вирусологических и молекулярно †иммунологическ исследований. Цель изобретения — увеличение репродукции ВЛКРС. Для этого в культуральную cp,ió.,,содержащую среду

Игла с 102 сыворо".êè крупного рогатого с ота вводят 5 „6-диметилбензимидг волин-Сс-м, iiлкобамидь (метилкобалам<ин) в концентрации от 0,074 10 до 2,5 ° 10 М, что позволяет увеличить репродукци<> вируса лейкоза на 30-50,, 1 табл. метглбен з имидаз слил — Со-метилкобамид (метилкобаламин) в концентрации от

0,074:10 до 2,5 10 . 1.

П р FE и ер.,Пля изучения стимулиру-ощей активности метилкобаламина на репрод; к<В!но вируса лейкоза крупного рогатого скота испол<ьзуют лины<> клеток И,К.

Перед пассажем Hс.е к-!.-Льтуры просматриваь". под микроскопом и определяют коли .естпг клеток при помощи камеры Горяева. Плз =,того клетки отделя.<> . от монослоя подогретым до

37 С 0>257-ням раствором трипсина, содержащим 0,02"57-ныл раствор версеEEB (1 1 трипс<иi< c,EHHBE<>T а клетки ) ресуспе><диру«>т в свежей среде роста (2 3 х 10 к E-I<>K< матрас), содержащей 10? сыворотки кров< крупного ро-.

1700053 гатого скота и антибиотики (пенициллин, 100 сд/мл, стрептлмицин, 100 ед/гтл). Клетки инкубируют при

37 С. Перевивки проводят через кажо дые 5-(> дней. Иэ одной материнской .культуры готовя" несколько дочерних, PB(-TR op«>I метилко(>лляг»иття Готовят нл физиологическом раст Зоре, автоклавируют при 0, 5> атм в тече«(не 30 мин и вводят н культуралытую среду (обычНо 1-? II>I) до коне тттттх концентраций:

0,07(т 10 11; 0 37 ° 10 «1", 0 74 1О Р

0 1«» 5,0. (iI Ку»т т ры Hbi— ращиваит при 37 "(; в течение 5-6 дней, 1

Парллгельнл (роводят контрольные опыты с той же культурой !Io известному способу, т > е. без добавления метилкобаламигов в срет(у роста, Через 5 суток т(у»п тура тьную жидкость иэ всех с(>(уцо3 с>ттт«та«от, образовавшийся монослой обрабатывают О, 257-ным раствором трипсина, содер .жащим О, 0257-IIIII раствор версеттл, разводят растттором Хенксл и подсчиты- 25 вают количество клеток в камере Го— ряевя.

В культу1>алт>ттлтт жидкости о«трет«,еляют вируспродуцир ующуо а.ктивность куттьтурьт путем измер>ен«тя ревертаэ ной

> акти««ности,,>(>«я этОГО култ>ту1> ллыт>>>то жидкОсть . (Обычно в объеме 20-23 гтл1 лгветлятотпутем цет»Т1>и(т>угт»рлвания «3 теч(3«тие

30 мин ри 5000 об/мин при 4оС. Вирус осаждают т(е«»трифугировлнием уже лбработанной жидкости в течение 90 мин при 30000 об/ми при 4 (над 2ОХ-ной сахарозой, приготовленной в 0,01 11 трис-НС1 буфере, рН 7,5, r.одержлщем

0,1 И >HEI(:). и 0,001 .1 Na ХПА.

Собранные вирусы 00 мкл лизируют в течение ?О мин при 2 t, в О 01 . 1, о. трис-НС1. буфере, pi-. 7,8, содержащем

О, 008 11 дитиотретттол, О, 2Х тритона

X-100 и ттроводят ретзертлэную реакции. ,т(ля этого 10 гтт(тт вирусного лизлтя прибавляют 90 мкл сме =и,,:(>öåðÿàè(åé

0,05 11 трис-НС1. буфер, рН 7,8, 0. 002 iã» дитиотреитол1 О, О?5> . трит(>«i Х-100, 5(>

О.,? 5 А o .../мл лли..-ллттглТ,О ((т, 0 008 >>т 111> () т /з Н (ч тт;,тт»д>т»тттрт»(1>осфлт (74 к "к ил пробу), «тттт(убт»руь>т 30 мин при 3:> (,. Реттер газ>тут(т релкт»иго остлнаттливяют доблттлением трттх>тлруксусттотт

55 кислоты дл к.>и(-твой концентрат(ии

7,5Х. Ослцлк «лнлсят 1(л мембранные

I I (1

"pëå трлфилт тi>11 (.I,тттплр (дилм(тр Т;ор

0,9 г(т((«т и тм(тря(от pлдиoлK1 иттиo(>ть в сци«ттиллят»ионном счетчике Я„-30.

Величина полученной радиоактивности характеризует реверта 3нуто активность анализируемого аликвлта вирусного лизата. Чем вьппе радиоактивность, тем более лизят активен в отношении реHPрта=-:и, Поскольку и3 литературы известно, что ревертазная активность (она определяется по величине радиоактивности) коррелирует с количеством вирусн«.тх частиц, то на основании величиH р лдт»лакT «»ВЕ» Ос T«I млжн О высчитят ь и количество образовавшихся вирусных частиц )3 контрольных вируспродуцирующих культурах и г, культурах, росших в присутствии стимулятора — метилкобаламиня в разных концентрациях. Данные так тх определений приведены в таблице.

Радиоактивность >клнтролын тх вирусных лизатон принята зя 1007, т.е. соответствует 39528 имп/мин. Поскольку радиоактивность в вируспродуцирующих культурах, росших в присутствии метилко бяламинл, выло е, т о солтвет ственнл и процентная величина вырастает, Видно „что стимуляция образования вирус«И х частиц в присутствии в среде мети>ттк блламина начинается уже при начальной концентрации 0,074 ° 10 ь .1 и перестает расти при концентрации

5,0 10 М.. Итак, наиболее эффективные концентрации метичкобаламина в плтательнли среде при образовании вирусных частиц являются от 0.37" 10 10 2„5> к10 И,. За пределами указанных кон— центраций, т.е. кул. тивация вирусной культуры при более высоких концентрациях метилкобаламипа нецелесообразна, плскол:.ку выход «зируса «Ie повьттцяется, и расход((метилклбаллмина повышаются, что экономически не выгодно. о

Тлкиы образом, введение метилкобяламина н питательную среду Игла с 107. сыворотки «(pyi»EI(>i (> рогатого скота позволяет увеличить репрлдукт,ио в«труса лейкоза нл 30-507 по сравнению с гроТОТИПОМ Л ТЕМ ЖЕ СЯМЬ(М H AMPHI>III«»TI> материальные расходы при накоплении вирусногл материала, (. > О p M g л а и з . > б p P т е EI и я

СЛОPo>> культивирования I>E»pyca лайв коза крут«ного рогатого скота, ->утем

«тт»ку(тц>л«3ания ттируспрлдуцирующей культя>т>т Б питлтеле ттот» cp(ip. Игла с дл блвлет- нем сы«злро-. ки крови крупного

1700053

Репродукция вирусных частиц лейкоза крупного рогатого скота в контрольных и обработанных метилкобаламином культурах (по сравнению с известным способом) 0,74

5 0

2,5

0,074 0,37

Радиоактивность, имп/мин 39528 43837 52849 54668 59925

59451

100 0 110 9 133 7 138 3

150,4

151,6.!

Составитель И.Тареева

Редактор Н.Козлова Техред Л.Сердюкова Корректор A.Обручар

Заказ 4443 Тираж Подписное

J3 ЯЯип

ППИ Государственного комитета по изобретениям н открытиям при ГЕНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д . 4/5

Производственно †издательск комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,!01 рогатого скота, о т л и ч а ю щ и Йс я тем, что, с целью увеличения репродукции вируса, в питательную среду дополнительно вводят 5,6-ди— метилбензимидазолил-Со-метилкобамид.

Концентрация метилкобаламина, Мх10 0,00

Репродукция вирусных частиц, в.

2. Способ по и.,, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью удешевления, 5,6-диметилбенэимидазолил-Спметилкобамид вводят в концентрации

0 074 10 -2 5 10 1,