Способ получения олигодезоксирибонуклеотидов

 

Изобретение касается нуклеотидов, в частности получения олигодезоксирибонуклеотидов, применяемых для синтеза генетических структур. Синтез ведут конденсацией 5-нуклеозидного компонента, находящегося на полимерном носителе, с 5-0-диметокситритил-N-ацил-3<SP POS="POST">1</SP>-0-метилгидрофосфитом нуклеозида в присутствии раствора йода в абсолютном пиридине с последующим блокированием не вступивших в конденсацию 5-гидроксильных групп нуклеозидного компонента и удалением 5-0-диметокситритильной группы. Эти условия позволяют сократить продолжительность процесса в 2,5 - 3 раза и объем растворителей в 3 - 6 раз, что в целом упрощает и удешевляет процесс. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ . СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (51)5 С 07 H 21 04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

IlPH ГКНТ СССР

1 (21) 4428349/23-04 (22) 08.04.88 (46) 07.02.90. Бюл. 1» 5 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт "Биотехнология" (72) С.11.Грязнов и В.К. Потапов (53) 547.455.07(088.8) (56) Грязнов С.:1., Чернов И.П., Потапов В.К. и др. Автоматический синтез 20-47-звенных полидезоксирибонуклеотидов Аосфитям»»дным методом ня синтезаторе "Виктория — 4 »1"Биорганическая химия, 1986, т.12, 1» 12,с.1604. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛГОТИДОВ (57) Изобретение касается нуклеоИзобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к способу получения Арягментов (1НК заданной первичной структуры — олигодезоксирибонуклеотидов, и может быть использовано для синтеза фрагментов генов, олигонуклеотидных праймеров, зондов и других генетических структур.

Цель изобретения — ускорение, упрощение и удешевление процесса синтеза олигонуклеотидов.

Цель достигается осуществлением постадийной межнуклеотидной конденсации 3 -нуклеотидного компонента, I в качестве которого используют 5 -0-диме то к с и тритил-N-à»»Hë-3(-0-метил( гидро(ос »»т нуклеозида с 5 -нуклео.»ид»»»»м компонентом в присутствии

„„SU„„1541215 А1

2 тидов, в частности получения олигодезоксирибонуклеотидов, применяемых для синтеза генетических структур. Синтез ведут конденсацией 5-нуклеозидного компонента, находящегося на полимерном носителе, с 5-0-диметокситритил-N — àöè»»-3 -О-мет»»лг»»дрофосф»»том. нуклеозида в пр»»сутств»п» раствора иода в абсолютном пиридине с последующим блокированием не вступивших в конденсацию 5-гидроксильных групп нуклеозидного компонента и удалением

5-0-диметокситритильной группы ° 3TH условия позволяют сократить продолжительность процесса в 2,5-3 разя и объем растворителей в 3-6 раз,что в целом упрощает и уде»невляет процесс °

1 табл. окисляющего агента — йода в абсолютном пиридине с последующим блокирова- Ql нием не вступивших в межнуклеотидную »(фаЬ конденсацию 5 -гидроксильнь»х групп нуклеозидного компонента (кепировани( ем) и удалением 5 -0-диметокситри- >,м

-тильной защиты. Сл

Пример 1. Синтез эйкозатимидиловой кислоты (Тр)<„ Т.

В реакционную колонку проточного типа помещают 20 мг силохрома С-80 с иммобилизовянным тимидином в коли- « честве 25 мкм/г. Полимерный носитель промывают абсолютным яцетонитрилом

20 с (0,6 мл), а затем последовательно добавляют 0,025 мл 0,1 1 раствора иода в абсолюг(»о"» пир(»дине и 0,025 мл

О, 1 11 раствора 5 -0-диметокситритипI

-3 -0-мет»»чг»»дро(зосф»»тя тимидина и! 541215

Время, с

Реагент

Операция

80С

0,05 11 КΠ— ОР— 0N

Н

Цежнуклеотидная конденсация

100 и 0,05 H Т в пиридине

СП С11

Пр о мнвк а

111 Ас.!0 в HeIm: Ft>N: CH>CN

1: 4, 5: 30 (ч/ !) Кепирование

Промывка 011 эС1 1

Детритилирование . 0,1 H C1 зСОО11 в СН,С1

Промывка СП С смесь выдерживают 40 с. Процесс повторяют, выдерживая реакционную смесь

60 с, Затем полимерный носитель промывают ацетонитрилом 10 с (0,3 мл) и обрабатывают кепирующей смесью состава 111Ас О в Helm : Гс.gN : СНзCN

1:4,5:30 v/v (Ие?тп — метилимидазол)

30 с, промывают абсолютным ацетонитрилом 20 с (0,6 мл) и детритилируют 10

40 с (1 мл) 0,1 H раствором трифторуксусной кислоты в хлористом метилене. После отмывки абсолютным ацетонитрилом 30 с (7 мл) полимерный носитель готов для проведения следующих синтетических циклов, которые аналогичным образом осуществляют еще

18 раз, По окончании синтеза полимерный носитель извлекают из реактора и обрабатывают 0,2 мл смеси тиофенол /триэтиламин/диоксан-1/1/2 U/к 30 мин, При синтезе гетерогенных последовательностей в качестве нуклеотидных компонентов на соответствующих спадиях используют 3 -0-метилгидрофосфи-! 45 ты 5 -0-диметокситритил-N-бензоиладе-! новина, 5 -0-диметокситритил-N-бензоилцитозина, 5 -0-диметокситритил-!

-N-изобутирил гуанозина и 5 -0-диметокситритил тимидина. По окончании 50 синтеза полимерный носитель обрабатывают как описано в примере 1 за исключением аммонолиза, который проводят 16 ч. Аммонолизат отделяют от полимерного носителя, концентрируют в 55 вакууме ° Целевой продукт выделяют методом электрофореза в полиакриламидном Гeле, Сpeдний выход продукта затем промыва!от диоксаном (4х0,5 мл), заливают 0,5 мл 28%-ного водного аммиака и выдерживают 30 мин при о

50 С ° Полимерный носитель отделяют от раствора, промывают водой (3 х х 0,1 мл), фильтраты объединяют, концентрируют в вакууме ° Реакционную смесь анализируют и выделяют целевой продукт методом обращенной фазовой

ВЗЖХ. Средний выход продукта межнуклеотидной конденсации на стадию в расчете на удаляемую (HeO)

98%, а на выделенный продукт 90%.

Пример 2.Получение гептадекануклеотида 5 СТААААССАСССССАСТ.

Синтез олигонуклеотида осуществляют аналогично синтезу эйкозатимидиловой кислоты в соответствии с картой-схемой, представленной в таблице. межнуклеотидной конденсации составля ет 89% на стадию в расчете на целевой продукт.

Таким образом, предлагаемый способ поэволяет сократить время каждого синтетического цикла в 2,5-3 раза и в 3-6 раз сократить объем используемых растворителей.

Формула изобретения

Способ получения олигодезоксирибонуклеотидов, включающий конденсацию

5 -нуклеозидного компонента, находящегося на полимерном носителе, с активированным 3 -нуклеотидным компонен-! том, блокирование не вступивших в межнуклеотицную конденсацию 5 -гидро-!

Составитель Г.Коннова

Техред М,Дидык Корректор H.111ароши

Редактор H. Гунько

Заказ 262 Тираж 299 Поцписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

5 1 5412 ксильных групп нуклеоЗиднbIX компонентов и последующее удаление S -0-диметОкситритильной защитной группы, о тл и ч а ю шийся тем что с цеЭ 9

5 лью ускорения, упрощения и удешевления процесса получения целевого продукта,в качестве активированного 3—

-нуклеотидного компонента используют

5 -0-диметокситритил-N-ацил-3 -0-меI I тилгидрофосфит нуклеозида, осуществляя конденсацию в присутствии раствора иода в абсолютном пиридине, а блокирование проводят непосредственно nocafe стадии конденсации.