Способ консервирования рекомбинантного штамма рsеudомоnаs species продуцента @ -2 интерферона

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДЛРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗО6РЕТЕНИЯМ И ОТКРЫГИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

Oil ИСАН И Е И ЗОБ РЕ "ГЕ Н И

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС ГВУ (21} 4678191/13 (22) 11.04.89 (46) 15,12.91. Бюл. ¹ 46 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии (72) Ю, И . Р и м к я в и ч е н е, К. Л . В ил у» и с, 3,В,В.Башкис, В.А,В,Бумялис, СЛ.Григишкис, 3.А.А.Янулайтис и С,Б.A.Пунтежис (53) 574.15(088.8) (56) Sharp Р.S. The Preservation of

Geneticaliy Unstabie Microorganisms and the

Сгуоргевегwtion of Fermentation Seel Cuitures,Advances in Biotechnoiogicai Processes, 1984, N З,р.81.

Реферон сухой для инъекций (Министерство медицинской и микробиологической промышленности), Вильнюс, НПО

"Фермент", 1988, с. 550. (54) СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ РЕ КОМБИНДНТНОГО LU TAMMA PSEUDGMONAS SPECiES — ПРОДУЦЕНТА Q -2 ИНТЕРЭЕРОНА

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для хранения генноинженерных штаммов.

Цель изобретенля — повышение выхода а -2 интерферона.

Сущность изобретения заключается в том, .что для продуцентов и-2 интерферона — рекомбинантных штаммов Pseudomonas

species, есть оптимальная точка консервации культур — 15 — 30 мин после достижения максимальной скорости роста для длительного хранения в жидкой среде с 15%-ным глицеринам и антибиотиками в замороженном состоянии и ри (-70) — (-196) С, способствующая повышению выхода рекомбинант„„5U „„1698285 А1

<. s С 12 N 1/04//(С 12 И 1/04, С 12 R 1:38) (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для хранения генноинженерных штал,л1ов. С целью повышения выхода а -2 интерферона для продуцентов а -2 интерферона — рекомбинантных штаммов Pseudomonas зр. установлена оптимальная точка консервации культур 15-30 мин после достижения максимальной скорости роста для хранения в замороженном состоянии при -(70)— (-196) С в жидкой среде с 15%-ным глицерином и антибиотuntaìè, Предлагаемый способ разработки для продуцента rt-2 интерферона — Pseudomonas sp. Ч6-84, несущего плазмиду VG-3 (депонирован во

ВНИИгенетика), а также ряда других штаммов-и родуце нтов рекомбина нтного й2 интерферона, позволяет повысить выход этого вещества;-осле 1,5 лет хранения в

0,5 1,74 раза в по ледующих ферментациях по сравнению с; saåc Hütì способол, 1 ил, 7

2 табл, ного интерферона;i-2 в последующих ферментациях, il р и м е р 1, Приготавливают для ферментера "Bios tat Е" фирмы "В.Brauni . Meisungen" емкостью 13,7 л с рабочим объемом 10 л питательную среду (10 л) следующего состава, r/ë: гидролизат казеина (ФС вЂ” 42 — 632 — 72 МРТУ 42) 120 мл/л; гидролизат пекарских дрожжей 5; калий фосфорнокислый двузамеьценный трехводный 1,5; калий фосфорноклслый однозамещенный

0,6; аммоний серчокислый 3; натрий хлористый 0,5; магний сернокислый семиводный

0,25: кальций хлсристый 0,011: тетрациклин 0,05; стрептомицин 0,15.

1698285

1 л этой среды разливают в 4х250 качалочные колбы и засевают (по 1 л) жидкозаконсервированной культурой Pseudomonas

species, несущей плэзмиду pVG-3 (штэмм депонирован во Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики), Колбы помещают на 20 — 22 ч в термостатирующие качалки при 30 — 35 С, Полученным инокулятом засевают ферменту, Ферментацию проводят при 30 — 35 С, pH среды поддерживают автоматически нэ

: уровне 7,0 — 7,1, пеногашение на уровне датчика, pOz изменяют по Динамике роста от 40 до 70 до насыщения.

Каждые 30 мин берут пробы для измерения оптической плотности и определения скорости роста клеток

Ф)

t (k) — t (k — 1) где Х(к), Х(к1) — оптическая плотность в моменты времени.

Полученное значение скорости роста бактерий Ч(к) сравнивают с предыдущим значением Ч(к->). Спустя 15 — 30 мин после удовлетворения условию Ч(ц — V(p-ö 0 культуру готовят к консервированию, Для этого в стерильных условиях центрифугируют 400 мл культуральной среды., осадок клеток ресуспендируют в 200 мл свежей среде указанного состава, добавляют антибиотики и 200 мл стерильного раствора 15;4-ного глицерина, Полученную суспензию клеток разливают по 1 мл в ! гластмассовые пробирки типа Эппендорф емкостью 1,5 мл. Емкость с пробирками

|. помещают в холодильник глубокого ох-лаждения при -20 С на 22-24 ч, а потом перемещают в кельвинэтор и хранят при температуре (-70...75) — (-196) С в течение

1,5 года.

Динамику биосинтеза рекомбинэнтного а-2 интерферона определяют иммунным методом.

Результаты экспериментальных исследований приведены в табл,1 и.отображены на чертеже, где нэ графике 5 исходного варианта отмечены цифрами в кру>кках точки консервирования. Консерванты, полученные в этих точках, были использованы для осуществления четырех ферментаций, которые в табл.1 обозначены соответствующими ваоиантами.

Из экспериментальных данных, пред5 ставленных на чертеже и в табл,1, следует, что по сравнению с исходной ферментацией в последующих ферментациях 1-4 биосинтетические свойства повышаются. Во

2-м варианте, где консервация осуществле10 на при максимальной скорости роста, выход продукта повышается на 7;4, а в 3-м вариант, где консервация произведена через 30 мин после достижения максимальной скорости роста, — нэ 20 . l5 Пример 2. Результаты обработки экспериментальнь х данных, приведенные в табл.2, показывают, .то предлагаемый способ консервации рекомбинантного штамма Pseudomonas species VG-84 - про20 дуцента а-2 интерферона, позволяет повысить выход продукта по сравнению с известным в 1,74 раза.

Предлагаемый способ пригоден для других штаммов Pseudomonas sp. проду25 центов рекомбинантного интерферона а -2, а именно штамм ауксотроф по аденину, другие двэ — no треонину. Каждый штамм обладает специфически обработанными плазмидами. Активность рекомбинантного

30 интерферона а -2 в ферментэциях, засеянных культурами; законсервированными по предлагаемому способу, ппвышается в

0,5-1.74 раза по сравнению с известным способом.

Формула изобретения

Способ консервирования рекомбиHaнтного штамма Pseudomonas species40 продуцентэ а -2 интерферона, предусматривающий отделение свежевыращенных клеток путем их центрифугирования, ресуспендирование осадка в свежей среде с глицерином и антибиотиками, консервиро45 вание в стеклянных или пастмассовых ампулах и хранение при -(70) — (-196) С, о т л ич э ю шийся тем, что, с целью повышения выхода интерферона, консервирование осуществляют через 15 — 30 мин после того, 50 как скорость роста достигает своего максимального значения.

Табяица1

1-й вариант

ВариИсходный вариант

О>010

О, 029

0,064

0,066

0,075

0,091

О, 083

О, 016

О, 036

0,033

0,006

0,036

О, 045

0,089

0,096

0,036

0,020

0,033

О

-0>008

2,2

1 83

3,32

4,35

3,57

3,2

3,6

3,3

2,0

П р и и е ч а н и е. с — время;

Х вЂ” концентрация микроорганивиов (бактерий);

V — cKGpocTb роста бактерий;, Т!ЧР— концентрациясб-2 интер>>ерова.

Продолжение табл,1

О 0>SS

2 3 0

3 6,0

3,5 8,37

4 11,6

4,5 13,0

5 14,5

5,5 16,0

6 16,5

6,5 16;2

О 0>87

1,5 1,9

2,5 3,7

3 5,5

3,5 8,75

4 9,12

4,5 12,75

5 14>5

5,5 16,75

6 17,0

2 ° 8

2,7

4>0

5,2

4,8

2,0

1,35

4,2

Таблица 2

По и е агаемом способ

По известном способ

Фермента ция

Максимальная активность из культуры, законсервированной 15 — 30 мин спустя после максимальной скорости оста х 10 ME/ë

Максимальная активность из культуры, законсервированной в середине экспонентной фазы роста,х 10 ME/л

О 1,25

1,5 2>12

2,5 4,25

3 . 6,5

3,5 S>75

4 11,25

4,5 14,5"

5 145

5,5 !5,25

6 15,5

0,56

2 1,31

3 3 5

4 6>25

5 11,6

5,5 14,5

6 15,6

6,25 15,9

7 17,4

7,5 17,4

8 17,15

0,009

0,035

0,075

0,075

0,083

О ° !О8

0>025

-0,008

2

4

3,7

4,67

3,0

1,64

О,ОЧ!.

0,030

0 060

0,066

0,054

0,121

0,058

0,075

0,008

2,7

2,1

2,75

2,28

3,3

2,62

0 0>Я!

1 1,4t

2,5 4,07

3 6,0

3,5 H,О

4 10,25

4>5 13,0

5 155

5>5 16,0

6 17,!

6,5 18,1

0,017

0,050

0,079

О, 107

О ° 056

0,050

0,050

0> Ctt16

-0,011

4,3

5,2

4,72

4,65

4,0

4,57

1698285

Редактор А. Огар

Заказ 4367 Тираж Г1одписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. )К-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

1ИГ, 10 ИГ/я

1б 18

Ото ю. р ю7.

Составитель В. Соина

Техред M.Mîðãåíòàë КоРРектоР И Уу ка