Способ получения антигенной детерминанты вируса спид

 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, и может быть использовано для обнаружения антител СПИДа и его вирусов в сыворотке крови человека или других биологических жидкостях, а также к иммунопрофилактической защите человека от СПИДа на основе применения белка. Сущность способа состоит в том, что последовательность ДНК, кодирующего остатки 15-512 (все, кроме первых 14 аминокислотных остатков) гена gag, вырезают из рекомбинантного фагового клона ДНХВ 3 и связывают с экспрессионной плазмидой E.coli pEV-vrf2 для получения плаэмиды pEV2/gag 15- 512Э Последовательности . ДНК, соответствующие аминокислотным остаткам 319-331 env, удаляют из экспрессионной плазмиды pEV3/env 44-460 путем направленного затравкой мутагенеза для получения плазмиды pEV3/env 44- 64 А 319-331, Направляемый затравкой мутагенез проводят на плазмиде pEV/ /env 44-640 Л 329-331 и получают , плазмиду pEV3/env 44-640 A319-331 А514-524, Фрагмент рестрикционной эндонуклеазы гена env из плазмиды pEV/env 44-640 А319-331 А514-524, кодирующий остатки env 467-640 Д514- 524 и env 467-640 А514-624, связывают с фрагментом pEV2/gag 15-512 и получают в результате гибридный ген, кодирующий остатки gag 15-436 и остатки env 467-640 А 514-524 в плазмкде PEV2/gag 15-436/env 467-640Д514- 524. На каждой стадии конструирования плазмиды репродуцируют путем трансформации в штамме MC 1061 (.pRK 248clts). с И

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (И) (1)5 С 12 N 15/ 8

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГХНТ СССР

1 (21) 4202330/ i 3 (22). 03.04.87 (31) 847671 (32) 04 . 04. 86 (ЗЗ) US (46) 23.04.91, Бюл. Р 15 (71) Ф.Хоффманн-Ля Рож унд Ко., АГ (СН) (72) Роберт Митчел Краул и Дэру Янг (US) (53) 575.224.2; 577(048)(088.8) (56) Crowl.R.et al. HTLV-III епч

products synthesired in Г.coli are

recognized by antibodis present in

sего AIDS patients (Dept. Ио1. Genet.

НоНпип-?.а-Roche Res Сеfr. Nat1еу, N 707110, US). Се11, l985, 41, Ф 3, р. 976-986. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННОЦ

ДЕТЕРМИНАНТЫ ВИРУСА СПИД (57) Изобретение относится к биотехнологии и медицине, и может быть использовано для обнаружения антител

СПИДа и его вирусов в сыворотке крови человека или других биологических жидкостях, а также к иммунопрофилактической защите человека от СПИДа на . основе применения белка. Сущность способа состоит в том, что последовательность ДНК, кодирующего остатИзобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для обнаружения антител СПИДа и его вирусов в сыворотке крови чело.века или других биологических жидкостях, а также в иммунопрофилактически 15-512 (все, кроме первых 14 аминокислотных остатков) гена яая, вырезают из рекомбинантного фагового клона НХВ 3 и связывают с экспрессионной плазмидой F..coli pEU-vrf2 для получения плаэмиды рЕЛ2/gag 15512, Последовательности ДНК, соответствующие аминокислотным остаткам

319-331 env, удаляют из экспрессионной плазмиды рГЧЗ/env 44-460 путем направленного затравкой мутагенеза для получения плазмиды pFVÇ/env 4464 Ь 319-331, Направляемый затравкой мутагенез проводят на плазмиде pFV/

/env 44-640 h. 329-331 и получают, плаэмиду рЕЧЗ/егч 44-640 b 319-331

6514-524. Фрагмент рестрикционной эндонуклеаэы гена епъ иэ плаэмиды

pEV/env 44-640 5319-33! Ь 514-524, кодирующий остатки env 467-640,514524 и env 467-640 b 514-624, связывают с фрагментом pEV2/gag 15-512 и получают в результате гибридный ген, кодирующий остатки gag 15-436 и остатки env 467-640 Д 514-524 в плазмкде pEV2/gag l5-436/env 467-640 $ 514524. На каждой стадии конструирования плазмиды репродуцируют путем трансформации в штамме F..coli NC 106 1 (pRK 248c It s ) . кой защите человека от СПИДа на осно-. ве применения белка.

Пример. Последовательность

ДНК, кодирующую остатки 15-512 (все, кроме первых 14 аминоконцевых остатков) гена gag, вырезают из рекомби1644 7? 0 нантного фагового клона Q HXB-3 и На каждой стадии конструирования связывают с экспрессионной плазмидой плазмиды репродуцируют путем трансфорE.co1i pEV-vrf2 для получения плазми- мацни в штамм Е.coli ИС1061 ды pRV2/gag 15-5 12. (pRK248r Its) .

Последовательности ДНК, соответст" вующие аминокислотным остаткам 319- Общая методика получения рекомби331 env удаляют из экспрессионной нантного вектора. плазмиды РЕЙЗ/env 44-640 пу ем на- Иасломасштабное выделение плазмиправленного затравкой мутагенеза для 10 дной ДНК из 1 мл насыщаемой в течение получения плазмиды РЕЧЗ/env 44-640 суток культуры проводят согласно мето б 319-331. дике Бернбойма, позволяющей выделять

Направляемый затравкой мутагенез для аналитических целей из бактериаль проводят на плазмиде pEVÇ/env 44-640 ной колонии небольшие количества дНК.

6 319-331 для удаления нуклеотидов, 15 Большие количества плазмидной ДНК покодирующих аминокислотные остатки 514- лучают из 1 л культуры согласно стан524, и получают плазмиду pEVÇ/env 44- дартной методике с применением центри640 6319-331 Ь 544-524. фугирования в хлористом цезии.

Фрагмент рестрикционной эндонуклеа- Для Рестрикционных эндонуклеаз едизы гена env из плазмиды РЕЧЗ/env 44- 20 ницу активности определяют как коли640 Ь 319-331 Ь 514-524, кодирующий честно фермента, необходимое для расостатки env 467-640 6 514-524, связы- щепления 1 мкг ДНК за 60 мин в общем вают с фрагментом pEV2/Нар 15-512 и реакционном объеме 0,05 мл при т.усв. получают в результате гибридный ген, 37 С. Рестрикционные растворы кроме кодирующий остатки gag 15-436 и остат-25 подвеРгаемой Расщеплению ДНК содеРжат ки env 467-640 Ь 514-524 в плазииде 100 мкг/мл альбумина бычьей сыворотки

pEU2/Нар 15-436/env 467-640 Q 514-524, и следующие буФерные компоненты:

II: 100 мМ NaC1, 10 мИ трис-НС1 (рН 7,4), 10 мИ MgCl и 10 мМ 2-меркаптоэтанола (2-ИЭ);

Gla I: 50 мМ NaC1, 6 мМ трис-НС1 (РН 7,9) и 6..ММ MgC1, Hjnc II; <100 .мМ NaC1, 10 мМ. трис-НС1 (рН 7,4), 7 .мМ И@С1 и 1 мМ дитиотреитола (ДТТ);

Hind III: 50 мМ NaC1, 50 мМ тряс-НС1 (рН 8) и 10 мМ ИяС1

Нра I: 6 мМ КС1, 10 мИ трис"НС1 (рН 7,4), 10 мИ MgC1< и 1 мИ ДТТ;

Pst I: 100 мМ NaC1, 10 мМ трис-НС1 (рН 7,5) и 10. MM MgC1<, Puv II: 60 мИ NaC1, 6 MM трис"НС1 (РН. 7,5), б MM МдС1е и 6 мМ 2-МЭ;

Stu g: 100 мИ НаС1, 10.мМ трис"НС1 (рН 8), 10 мМ МяС1 и 6 мМ 2-МЭ.

Связывание Т4 ДНК лигазой.прово- 40 дят при 16 С в смеси, содержащей ДНК < и 50 мМ трис-НС1 (pH 7,8), 10 мИ.

MgClg, 20 мМ ДТТ, 1 мМ АТФ и

50 мкг/мп. альбумина бычьей сыворотки.

Единицу активности Т4 ДНК лигазы оп-.. ределяют как количество, необходимое для 50 -ного связывания фрагментов

Hind Ш лямбда-ДНК за 30 мин при

16ОС в 20 мкл инкубационной смеси и концентрации 5 -концов ДНК 0,12 мкИ (300 мкг/мл).

Очистка фрагментов ДНК в агарозе.

После расщепления с помощью рестрикционной эндонуклеазы предназначенные для клонирования фрагменты ДНК выделяют электрофорезом в l -ной агарозе. После проявления с помощью

1 мкг/мл этидийбромида тонкие слои геля, содержащего целевые фрагменты

ДНК, экстрагируют через иглу 21 раз"< мера в 4 мл раствора, содержащего

10 мМ трис-НС1 (рН 7,4), 1 мМ ЭДТА и 300 мМ NaC1. Полученную смесь вымораживают 3 ч при -80 С, оттаивают

30 мин при 37 С и центрифугируют при

10000 g в течение 30 мин. Полученную жидкость фильтруют через фильтр Millех 0,45 мк, концентрируют до объема

0,25 мл и трижды осаждают втор-бутанолом и этанолом с 10 мкг Е.coli тРНК {транспортная РНК) в качестве носителя.

Культуральная среда.

Среда М9СА содержит 10 r Na+HP04, 3 г КН РО4, 0,5 г NaC1 и 1 r ИЙ4С1 на 1 л с 1 мИ МяЯО4, 0 5 глюкозы и

0,5 казаминокислот при РН 7,4.

Бульон Луриа (БЛ) содержит 5 г бакто-дрожжевого экстракта, 10 r бак1644720 то-триптона и 10 r NaC1 на 1 л при рН 7ф5 °

Там, где указано, добавляют антибиотики тетрациклин и ампицилин до их окончательной концентрации саответст5 венно 15 и 50 мкг/мл.

Трансформация и выделение рекомбинантов.

Трансформацию штамма Г.col i МС1061 (plK248cIts) проводят следующим образом.

200 мп бактериальных клеток выращивают при 30 С в БЛ до значения О.П.,1 (оптическая плотность) О, 5 — 1, посл е15 чего клетки собирают центрифугированием при 6000 g и 4 С 5 мин, вновь суспендируют в 50 мп раствора, содержащего 10 мМ морфолинапропансульфоновой кислоты (МОПС, рН 7) и 10 мМ 20

RbC1. Клетки собирают центрифугированием и вновь суспендируют в 30 мп раствора, содержащего 10 мМ МОПС (pH

6,5), 50 мМ СаС1с и 10 мМ RbC1 °

После инкубирования в течение 30 мин 25 при 0 С клетки собирают, вновь суспендируют в 6 мп 10 мМ МОПС (рН 6,5) с

50 мМ CaClZ, t0 мМ RbC1 и 157. глицерина и в 40 пробирок Эппендорфа

{300 мкл на пробирку) отбирают аликво- 30 ты, которые эамораживают до -80 С.

Трансформацию проводят оттаиванием аликвоты на 100 мкл клеток и инкубируют 30,2 и. ? мин соответственно при О, 37 и О С в присутствии образца о лигазной смеси в 10 мкл, содержащего примерно 100 нг HK, и добавлением в пробирку 0,1-0,5 мп БЛ, Пробирку затем инкубируют 60 мин при 22 С, после чего разливают па 200 мкл клеточ- 40 ной суспензии в БЛ, содержащем ампицилин, и инкубируют 20 ч при 30 С ° о

I б

Индуцированные клетки, суспендированные в трис-глициновом (ТГ) буфере, смешивают с равным объемом электрофо" ретического буфера, инкубируют 5 мин с при 95 С и по методике Лаэммпи подвергают электрофорезу в 12,5Х-ном полиакриламидном геле. После электрофореза оелки из геля элюируют в течение 6 ч при 95 В в 12,5 мМ трис- .и 96 мИ глицина с 20Х метанола и 0,013 SDS, рН 7,5 на нитрацеллюлозную мембрану (0,1 мк) . Затем проводят анализ Вестерн-пятен, Направляемый затравкой сайтспецифичный мутагенеэ проводят согласна методике Маринага. Используемые в мутагенезе искусственные олиганукпеатиды синтезированы фосфитным методом с применением автоматического синтезатора и очищены электрафореэом. на по".-. лиакрилаьждном геле.

При гибридизации колоний в качестве индикатора для гибридизации используют тот же олигонуклеатид, что и в направляемом затравкой сайтспеци.фичном мутагенезе, после мечения 5 конца с помощью P (АТФ с применением полинуклеотидкинаэы) .

Конструирование плазмиды pEV2/gag

15-5 12 .

Конструкцию конечной экспрессиончой плазмиды, кодирующей гибридный белок gag/env, получают конструированием плазмидьr (pHVZ/gag 15 "512), содержащей нуклеотиды, кодирующив все, кроме первых 14, аминокислотные концевые остатки. Некоторые нуклеотиды, кодирующие карбоксилконцевые остатки

gag, затем замещают последовательностями env с получением конечнога гибридного продукта.

Выращивание клеток и индуцирование экспрессии гена. 45

Культуры Е.coli МС1061, содержащие плазмиду pRK248clts, и экспрессионную плазмиду выращивают в среде М9СА при

30 С до средне-log фазы и затем температуру повышают до 42 С с целью инако тивации фР, репрессора. После 2 ч инкубирования при 42 С клетки из 1 мп о индуцированной культуры отделяют центрифугированием и вновь суспендируют в ТГ-буфере, содержащем 10 мМ трисНС1 (рН 7,4) и 10Х глицерина, для получения аналитического препарата.

Электрофорез íà SDS-полиакриламидном геле и анализ Вестерн-пятен.

Для приготовления плазмиды pEV2/

I/gag 15-512 ДНК-последовательность,,кодирующую остатки 15-512 белка gag, получают иэ 50 мкг рекомбинантного фагового лямбда клона Я НХВ-3 содержащего провирусный геном HTLV-III.

ДНК подвергают расщеплению в присутствии Cla I (50 единиц) и Hinc II (50 ециниц) в течение 120 мин при

37 С для получения фрагмента в

1700 п.а. (пар оснований). Фрагмент

ДНК выделяют препаративным электрофарезам в агароэном геле и вновь суспендируют в 0,1 + TE-буфере (1 мМ трисНС1 (рН 7,4) с 0,1 мМ ЭДТА) Да ОКОНчательной концентрации 0,03 пмаль/мкл.

1644720

Для получения Фрагмента ДНК gag

2 мкг экспрессионной плазмиды Е.roli pEV-vrf 2 расщепляют с помощью

С1а 1 (5 единиц) и Pvu II (5 единиц) в течение 60 мин при 37 С и электрофореэом на 1%-ном геле агарозы выделяют Фрагмент в 1700 п.о., содержащий

QP<, промотор. фрагмент ДНК после предварительного осаждения этанолом 10 вновь суснендируют до окончательной концентрации 0,03 пмоль/мкл.

Используемая при таком конструиро" вании плазмида pEV-ггпу 2 является производной легко доступной плазмиды 15

pBR322 (АТСС 31344), фаговый лямбда .клон g HXB-3 получен использованием о стандартной методики с рекомбинантной

ДНК из указанной клеточной линии Н-9, зараженной HTLЛ-ХХХ. Зараженная

ННЛ-III линия клеток человека обо..значена Н9-HTLV-IIIB и депонирована в Американской коллекции типовых культур под регистрационным Ф CRL

8543. Знание последовательности гено-. ма НТ?Л-III позволяет легко сконструировать ДНК-индикатор.„для выделения генома из Н-9 или любых других линий, способных к распространению вируса.

0,03 пмоль фрагмента gag/Сlа IHinc II смешивают с 0,03 пмоль фрагмента pEV-vrf2/С1а I- Puu II и связывают с помощью Т4 ДНК-лигазы (200 единиц) в течение 18 ч при 15 С о в конечном объеме 10 мкл. Продукт связывания затем трансформируют в штамм E,соН МС1061 (pRK248cIts) и трансформанты отбирают путем выращивания на агаровых пластинках БЛ с ампицилином после инкубирования 18 ч при 30 С. ДНК рекомбинантных плазмид анализируют для выявления нужного размера отщепленного фрагмента после 45 расщепления рестриктазами Bgl II, Pst I или Hind III. Продукты выделения, прошедшие анализ по размеру, за" тем отбирают с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и анализа

Вестерн"пятен на наличие предшественника gag, Культуры клеток, содержащих плазмиду pEV2/gag 15-512, индуцируют при

40 С а дубликатные образцы индуциt

55 рованных клеток готовят для электро-. форетического анализа в полиакриламидмидном геле. После электрофореза гель разделяют на две части, одну половину окрашивают бриллиантовым голубым Кумасси, в то время как вторую сторону геля подвергают электроэлюции и анализу Вестерн-пятен с применением антител к gag.

Анализ показывает, что индуцированные клетки продуцируют белки, мигрирующие в геле в виде двух основных полос и имеющие молекулярный вес при-. мерно 56 и 53 кД. Размер полного белка gag 15-512 примерно 56 кЦ. Оба основных белка реагируют с анти елами к gag. Наблюдается также ряд меньших по количеству низкомолекулярных белков, вступающих в реакцию с антителами.

Конструирование плаэмиды pEV3/env

44-640 А 319-331.

Экспрессионная плазмида рЕЧЗ/env

44-640, конструирование кот6рой из плаэмид ф HXB-3 и pEV-vrf описано

Кроулем, направляет синтез НП.V-III

env — специфичного белка 68-кД в E. coli. ДНК-последовательности, соответствующие аминокислотным остаткам епч

319-331, удаляют с помощью направляемого затравкой мутагеиеза с использованием 18-шег искусственного олигонуклеотида, имеющего последовательность 5 GCA ТТТ GTT ААС ATT AGT 3

Такой олигонуклеотид предназначен дополнять env-последовательности с тем, чтобы присоединять нуклеотиды, кодирующие остаток 318 к нуклеотидам, кодирующим остаток 332. В результате соединения указанных последовательностей в плазмидную ДНК вводится новый уникальный участок Нра I с одновременным удалением фрагмента в 39 п.о. Для образования пробела (gap") для гетеродуплексной молекулы в плазмиде pEV3/env 44-640 использованы сайты Stu I u Hind Ш.

ДНК из выделенных колоний, гибридизующиеся с. Р-меченным искусст венным олигонуклеотидом, трансформируют в МС1061 (рВК248сХйз) и анализируют на присутствие нового уникального Нра I участка.

Конструирование плаэмиды рЕЧЗ/env

44-640 Ь 319-331 6 514-524 °

Второе удаление в рамках кодирующих env-последовательностей проводят с помощью направляемого затравкой мутагенеза с использованием искусственного олигонуклеотида, имеющего последовательность 5 AGA ССА GTG

1644 720

Pro Gly G1y Lys Lys. Lys Tyr Lys Leu Lys His I1e Val Trp Ala.

Ser Arg Glu Leu Glu Acg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu

Tt r Ser Glu G.1y Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu Gln Pro Ser

Leu Gln Thr Gly Ser Glu G1u Leu Arg Ser Leu Tyc Asn Thr Ча1

Ala Thr Leu Tyr Cys Val His G1n Arg Ile Glu Ile Lys Asp Thr

Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys

Sec Sec Gln

Gln Gly Gln Met

Asp Thr Gly

Gln Asn I1е

Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Тгр Val Lys

Pro G1u Val Ile Pro Met Phe

Lys Ala Phe Ser

G1u G1y Ala Thc

G1y Gly His G1n

Glu Glu Ala Ala

Val Val Glu G1u

Ser Ala Leu Ser

Leu Asn Thr Va1

Giu Thr 1le Asn

Pro GIn Asp

Ala Ala Met

Leu Asn Thr Ие

G1n Met Leu Lys

G1u Trp Asp Acg Val His Pco

Val His Ala Gly Pro I1e Ala Pro Gly С1п Met Arg Glu Pro Acg

G1y Бег Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile

GCA GCA GGA 3 . Этот олигонуклеотид располагает последовательности, кодирующие остаток 513 белка env, рядом с последовательностями, кодирующими остаток 535 тем самым способствует удалению нуклеотидов, кодирующих остатки 514-524. Удаление осуществляют в плазмиде расщеплением по рестрикционным участкам Нра I u Elind III с 1ð созданием однонитевого пробела

l("8ар") в пределах env — области.

После повторного трансформирования

ДНК из положительных продуктов, идентифицированных с помощью Ð-меченного олигонуклеотида, анализируют на предмет удаления 33 п.о. с помощью расщепления рестриктазами Нра Х и

kiind III и электрофореза в 17-ной агарозе. Такое удаление также подтверждают установлением ДНК-последовательности с последующим применением метода химического расщепления.

Удаление Д 514-524 приводит к значительному повышению экспрессии env.

Конструирование плазмиды pEV2/gag

1 5-436/env 467-640 514-524.

2 мкг ДНК pEV2/8ag 15-512 подвергают рестрикции либо Cla I (5 ед) и В81 II (4 ед) с получением фраг- 30 мента примерно в 1300 п.о., кодирующего остатки 15-436 pag либо с по— мощью Pst I (10 ед) и Cla I (5 ед) с получением фрагмента примерно 1 Кб, Net Asn Arq I1e Arg Ile His Arg

1 уг Lys Ala Gln Gl n Ala Ala Ala

Va1 Ser Gln Asn Tyr Pco Ile Val содержащег о ф Q Г, промотор . О, 3 мкг

ДНК рЕЧ3/env 44-640 А 319-331 Д 514524 подвергают рестрикции с помощью

Pst I (10 ед) и В81 II (4 ед) с получением фрагмента размером примерно

4 Кв, кодирующего остатки env 467640 g 514-524. Полученные фрагменты

ДНК разделяют в 17.-ной агарозе и выделяют. 0,03 пмоль ДНК каждого выделенного фрагмента ДНК смешивают и связывают 18 ч при 15 С в присутствии

Т4 ДНК-лигазы (2 )0 ед). Лигазной смесью трансформируют МС1061 (pRK248cIts)

l продукты трансформации отбирают на пластинках с БЛ, агаром и ампицилином. Плазмидную ДНК получают из уникальных колоний и анализируют на нравильность размеров рестрикционных; фрагментов после расщепления рестриктаэой Рич II.

Одиннадцать из 1? выделенных клонов дают требуемые Puv ХХ-фрагменты

ДНК размером 3505 и 2882 п.о. Два про" шедших анализ клона отобраны для синтеза гибридного белка 8a8/env. Эти культуры клеток инпуцируют, образцы клеток отбирают для электрофоретического анализа в SDS-полиакриламидном геле, электроэлюции и анализа Вестерн-пятен.

Отобранные клоны синтезируют белок следующей аминокислотной последоваjтельности:

Trp Glu Lys I1e Arg Leu Arg

1644 720

G1y Trp Met Thr Ави Аап Pro Pro I le Pro Val Gly Glu I le Tyr

Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr

Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp I3e Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro

Phe Arg Asp Tyr Val

Gln Ala Ser Gln Glu

Val Gln Asn Ala Asn

Asp Arg

Val Lys

Phe Тук ? ye Thr Leu Arg Ala Glu

Asn Тгp Net Thr Glu Thr Leu Leu

Pro Asp Cys Lys

Leu Glu Glu Иес

Thr Ile Leu Lys Ala Leu

Met Thr Ala Сув Gln Gly

Gly Pro Ala

Ala Thr

Pro Gly

Gly Gly

Gln Val

His Lys Ala Arg Va1 Leu Ala Glu Ala Met Ser

Thr Asn Thr Ala Thr Ile Met Met Gln Arg Gly Asn

Phe Arg Аsn

Glu Gly. His

Gln Arg

Thr Ala

Lys Net Val т ув

Arg Asn Сув Arg

Cys Phe Asn

Ala Pro Arg

Cys Gly Lys

Lys Lys Gly

Суб Tr p Lys Cys G1y

Glu Arg С1р Ala Asn

Lys Glu Gly His Gln Net Lys

Phe Leu Gly Lys I le Phe Arg

Asp Cys Thr

Pro Gly Gly

Lys Tyr Lys

Gly Asp Net Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr

Val Va1 Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lyc Ala Lys

Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg Ala Va3. Ala Ala Gly Ser

Thr Net Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val С1л Ala Arg Gln

Leu Ьeu Ser Gly Ile Va3. Gln Gln Gln Asn Asn Ьeu Leu Arg Ala

Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu G1n Leu Thr Val Trp Gly Ile

Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys

Asp Gln G1n Leu Leu Gly I1e Trp Gly Сув Ser Gly Ьув Leu Leu

Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser

Leu Glu Qln Ile Trp Asn His Thr Thr Trp Ие Glu Trp Asp Arg

Рго 61у 61у Ьув. Lys Lys Tyr I ye Ьец Lye His Ile Val Trp Ala

Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu

Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly G1n Leu Gln Pro Ser

Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Бег Leu Tyr Asn Thr Val

Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Phe Asn А?а Val Val Tyr His Ser

/ 7

Таким образом, изобретение позво- gp ной ДНК,. кодирующей антигенную детер" ляет получить белок, который имеет минанту вируса СПИД, трансформацию по меньшей мере одну антигенную де- плазмидой штамма бактерий Escherichia терминанту, соответствующую последо" coli, культивирование, выделение и вательностям белков gag u env вируса очистку целевого продукта, о т л иНТЗЪ-III. 45 ч а ю шийся тем, что, с целью повышения специфичности антигена, Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я конструируют рекомбинантную плазмиду

pEV2/gag 35-436/env 467 640 Ь 534 524ю

Способ получения антигенной детер- кбдирующую синтез слитого белка gag/ минанты вируса СПИД, включающий кон- /env, со следующей аминокислотной струирование рекомбинантной плазмид- последовательностью: !

Met Aen Arg I1e Arg Ile His Arg Ткр Glu Lye Ile .Arg Leu Arg

1644 7? О

Glu

Ile Lys

Thr

Asp

Ile

Ala

Thr

Уа l

Gln

Leu

Tyr

Arg

Сув

His

Gln

Ala

Asn Lys

Glu

Ile

Glu

Glu

Ser

Lys

Glu

Lys

Leu

Asp

Ьys

Ser

His ger

Gly

Thr

Ala

Ala

Gln

Ala

Ala

Asp

Lys

Lys

Gln Gly Gln

Ala Trp Val

I)e Pro Met

I le

Val

Gln

Ile

Gln

Met

Lys

Phe

Asn

Чаl

Pro

Туг

Ser

His

Ile

Gln

Asn

Leu

Ala

Val

Thr

Ser

Pro

Arg

Glu

Va1

Glu

G)u

Ala

Phe

Уаl

Val

Pro

Ser

Lys

Thr

Leu

Gln

Ala

Gly

Glu

Leu Asn

Gln Met

Thr

Pro

Alà

Asp

Net

Ala

Leu

Ser

Met

Ser

Val

His

Ьуs

G1n

Gly

Gly

Thr

Asn

Leu

Glu Trp

Asp

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

G1u

Gln

Met

Gly

Ala

I le

His

Pro

Gly

Ala

Pro

Val т1е

G1п

G1n Q1».

Thr

Leu

Thr

Ser

Thr

Gly

Ala

11е

Asp

Gly

Gly

Ser

Trp

Thr

Ile

Gly Glu т)е

Val Arq Met

Pro Lys Glu

Чаl

Pro

Pro

Pro

Asn

Asn

Met

Ile

Tyr

Ьуе

Leu

Gly

Asn

Leu

I1e

Ile

Trp

Ьуs

Pro

Gly

G1n

Ile

Asp

Leu

I le

Thr

Ser

Pro

Ser

Thr

Lys

Phe

Val

Туг

АВр

Tyr

Asp

Phe

Arg

Thr

Va1

tys

Met

Тгр

Gln

Ala

Ser

Gln

Lys

Asp Cys

Glu Glu

Ile

Thr

Pro

Asn

Ala

Gln

Val

Asn

Met Thr

Gly

Thr

Met

Ala

А)а

Pro

Val

Н18

Ala

Leu

Lys

Arg

Gly

Gly

Val

Pro

Thr

Gly

G1n

Val

Ser

А1а

Thr

Met

Ile

Met

Thr

Asn

Phe

Val

Met

Lys

Arg

tys

Arq

Gln

Arg

Ala

Asn

Phe

Glu

Arg

Gly

Cys

His

Ala

Asn

Pro

Thr

His

Thr

Gly

G1u

Cys

Gly

Gln

Met

Lys

Gly

Cys

Trp

Arg

Cys

G)u

Gly

Ile

Phe

Gly

Lys

Leu

Phe

Asn

А1а

Gln

Gly

Val

Ser

Glu

Туг

Ala

Lys

Met

Lys

Val

Arg

I le

Val

Leu

Arg

Asp

Asp

Чаl

Trp

Asn

Ьуа

Ча l

Ala

Gly

Glu

Рго

Pro

Leu

Чаl

А1а

Gln

Lys

Glu

Arg

Thr

Arq

Met

Arg

Arg

Ala

Gly

Gln

Gly

Ser

Ala

Val

Thr

Ala

Thr

Leu

Ser

Met

А1а

I1e

Gln

Gln

Gln

Leu

Asn

Val

Leu

Arg

G1y

Leu Leu

Val Trр

Asn

His

Ile

Ile

Gln

Glu

Gln

Thr

Leu

Leu

Leu

I le

Gln

Ala

Val

Glu

Ala

Leu

Gly

Gln

Leu

I le

Trр

Gly

Cys

Leu

Ser

Ser

Thr

Va1

Trp

Asn

Ala

Ala

Pro

Trp

His

Thr

Gln

Ile

Th.г

Trp

Ala

Met

Val

Asn

TI p

Glu

Phe

I le

Asn

Thr

Ser

Asn

Туг

I этой плазмидой трансАормируют штамм

E.ñî1i АТСС Р 53338, а в качестве

Lys

Asp

Cys

Leu

Gln

Gln

Thr

Glu

А ц Val His Pro

Arg Glu Pro Arg

Leu Arg Ala Glu

Glu Thr Leu Leu

Leu Lys Ala Leu

Ala Cys Gln Gly

Ala Glu Ala Met

Gln Arg Gly Asn

Asn Cys Gly Lys

Arg Lys Lys Gly

Lys Asp

Arg Pro

Tyr Lys

Thr Lys

Ala Ala Gly Ser

Gln Ala Arg Gln

Arg Tyr Leu Lys

Gly Lys Leu Leu

Ser Asn Lys Ser

Glu Trp Asp Arg

Val Туг His Ser целевого продукта выделяют и очишают слитый белок gag/епч.