Фрагмент гена gаg htlv-i/ii, рекомбинантная плазмидная днк рatlg 579, штамм бактерий escherichia coli hb101/patlg 579- продуцент полипептида g579
Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии, иммунологии и может быть использовано для проведения серодиагностики HTLV-I/II. Изобретение представлено новым, оригинальным, искусственно созданным плипептидом, состоящим из продукта экспрессии фрагмента гена gag HTLV-1, слитого с бета-галактозидазой E.coli, и реагирующим с антителами к продукту гена gag HTLV-I/II, фрагментом ДНК ATLG 579, штаммом E.coli HB101, трансформированным рекомбинантной плазмидой pATLG 579, содержащей фрагмент ДНК ATLG 579. Источником HTLV-I/II-gag-специфических нуклеотидных последовательностей служили мононуклеарные клетки HTLV-инфицированного донора. Фрагмент ДНК, соответствующий области гена gag HTLV-I/II и кодирующий область генома с координатами 1253 - 1952 п.н., был амплифицирован в цепной полимеразной реакции (PCR). Рекомбинантная плазмида pATLG 579 получена путем лигирования с использованием ДНК-лигазы фага Т4 ДНК амплифицированного фрагмента (размером 699 п.н.), выделенного из агарозного геля и гидролизированного ферментами BamHI и ClaI с линеаризированной формой ДНК плазмидного вектора pUR 290. После инкубации компетентные клетки E.coli трансформируют гибридной ДНК с последующим отбором трансформированных колоний клеток. Изобретение позволяет получать с 1 л клеточной суспензии 200-350 мг белка, обладающего антигенными свойствами HTLV-I/II. 3 с.п. ф-лы.
Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии, иммунологии и может быть использовано для проведения серодиагностики HTLV-I/II.
T-лимфотропные вирусы человека I и II типа (human T-cell lymphotropic viruses type I and II, HTLV-I/II) относятся к семейству Retroviridae, подсемейству Oncovirinae. К этому подсемейству относится также вирус лейкоза крупного рогатого скота (bovine lymphotropic virus, BLV) и T-лимфотропные вирусы обезьян (simian T-lymphotropic virus, STLV). HTLV-I/II проявляют высокую тропность T-лимфоцитам, особенно к субтипу хелперов с фенотипом OKT4/leu3+, причем вирусы вызывают их неопластическую трансформацию. На первых стадиях вирусной инфекции T-клетки теряют цитотоксические свойства, а позже оказываются неспособными распознавать антиген-мишень [1]. Вирус лейкоза человека I типа этиологически ассоциирован с HTLV-I-зависимым T-клеточным лейкозом/лимфомой взрослых (adult T-cell leukemia/lymphoma, ATL) [2], протекающим как в острой, так в хронической и латентной формах. Кроме того, провирусная ДНК найдена у пациентов со сходными гемобластозами. Не исключено, что инфекция HTLV-I играет роль в этиологии различных B-клеточных лимфом [3]. В странах Южного полушария инфекция HTLV-I также может приводить к развитию HTLV-I-accoциированной миелопатии/тропического спастического парапареза (HTLV-I-associated myelopathy/tropical spastic paraparasis, HAM/TSP), протекающих в виде медленной прогрессивной миелопатии с высокой летальностью [4]. Другими воспалительными состояниями, в ряде случаев ассоциированными с HTLV-I инфекцией, возможно, являются альвеолит, полимиозит, артрит, инфекционные дерматиты, HTLV-I-ассоциированный синдром Шегрена, увеит [5]. Напротив, клиника HTLV-II ассимптоматична, поскольку не найдено достоверных, ассоциированных с этим вирусом заболеваний. Однако в ряде случаев отмечается лимфогрануломатоз и "тропическая" атоксическая нейропатия. Заражение лифотропными вирусами человека I и II типа, по-видимому, происходит при попадании в кровяное русло зараженных лимфоидных клеток. Основные пути передачи вируса включают парентеральный, половой и вертикальный. HTLV-I известен как эндемик на Юго-Востоке Японии, в Восточной и Центральной Африке, в Меланезии. Высокий уровень инфицированности вирусом показан также для некоторых изолированных популяций, таких как индейцы Южной Америки, Австрало-Меланизийские аборигены, изолированные популяции евреев в Иране и пигмеи Центральной Африки [6]. Филогенетический анализ последовательности ДНК HTLV-I позволяет разделить этот вирус на три больших класса, названных по их географическому распределению, а именно: Меланезийский, Центрально-Африканский и Космополитический (наиболее широко представленный). Более детальная характеристика, основанная на сиквенсе LTR-последовательности, подразделяет Космополитический класс на 4 субтипа - A (Трансконтинентальный), B (Японский), C (Западно-Африканский) и D (Северо-Африканский). HTLV-II - эндемик среди индейцев Юга, Севера и Центральной части Америки, пигмеев Центральной Африки и коренного населения Центральной Азии. Следует отметить, что за последние 15-20 лет наблюдается неуклонный рост числа инфицированных в странах Европы - Италии, Испании, Англии. HTLV-II в молекулярном плане подразделен на два прототипа, описанных как субтип A (MO) и субтип B (NRA). Инфицированность HTLV-I/II среди основных популяций эндемиченых регионов у клинически здоровых носителей составляет от 0.5 до 20.0% случаев в зависимости от пола и возраста. На всей остальной территории содержание антител в сыворотках крови здоровых доноров и случайно отобранных групп населения либо отсутствует, либо крайне низко и не превышает 0,01% [7, 8]. Важно отметить, что в странах Европейского сообщества основными группами риска являются проститутки, венерологические больные, наркоманы, применяющие наркотики внутривенно, пациенты, нуждающиеся во множественных переливаниях крови, а также дети, рождающиеся от инфицированных матерей. Значительная часть выявляемых вирусоносителей проживает в мегаполисах со значительным числом выходцев из эндемичных регионов. Общее число инфицированных на 1996 год составило более 20 миллионов человек. На территории России эпидемический очаг был обнаружен на о. Сахалин [8], в остальных регионах России отмечались лишь спорадические случаи [7, 8]. Отсутствие эпидемического характера распространения HTLV-I/II на всей территории России возможно связано с незначительным количеством заносов вируса из эпидемических очагов и возможно отсутствием разнообразия субтипов HTLV-I/II. Поэтому для более корректного обследования сывороток людей, проживающих на территории России, на содержание антител к HTLV-I/II антигены для иммуноферментных систем необходимо производить при использовании плазмид, полученных на основе отечественных изолятов. В данном изобретении используется полипептид, полученный при помощи плазмиды, содержащей ген gag (общий для HTLV-I и HTLV-II), выделенный от инфицированного донора, проживающего на территории России. Область gag вируса лейкоза человека локализуется в районе 824 - 2113 пар нуклеотидов (п.н.) генома и кодирует общий предшественник GAG с молекулярной массой 53 кДа, который нарезается с помощью вирусоспецифической протеазы на три группоспецифических белка p19, p24 и p15 - (824-1214 п.н.), (1214-1855 п.н.) и (1855-2119 п.н.). Белки GAG являются основными компонентами вирусной частицы, образуя сердцевину вириона, матрикс и нуклеокапсид соответственно вышеприведенным координатам. Сущность данного технического решения состоит в том, что предложен новый, оригинальный, искусственно созданный полипептид, состоящий из продукта экспрессии фрагмента гена gag вируса лейкоза человека, слитый с бета-галактозидазой E. coli, связывающий антитела к продукту гена gag HTLV-I/II, фрагмент ДНК ATLG 579, штамм E.coli HB101, трансформированный рекомбинантной плазмидой pATLG 579, содержащей фрагмент ДНК ATLG 579. Штамм-продуцент характеризуется следующими признаками: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные. Клетки хорошо растут на среде LB и других питательных средах, используемых для культивирования Escherichia coli, и простых питательных средах, содержащих 30-50 мкг/мл ампициллина. При росте на жидких средах клетки образуют ровную интенсивную муть. При выращивании на питательных агаризованных средах при 37oC колонии клеток гладкие, круглые, блестящие, серые, мутные, прижатые, края ровные. Клетки хорошо растут в пределах от 4 до 45oC при оптимуме pH от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота клетки используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и органические формы в виде пептона и аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. В качестве источника углерода используют глюкозу и фруктозу. Желатину не разжижают, мальтозу не сбраживают, индол не образуют, ацетат не усваивают; уреазная активность не обнаружена. Трансформация компетентных клеток E.coli HB101 плазмидой с промотором LacZ оперона проведена по стандартным методикам. Полученные клоны клеток с плазмидами выращивают на среде LB при температуре 37oC. Продуктивность штамма при использовании плазмидного вектора экспрессии pUR290 с lac-промотором составляет около 200-350 мкг рекомбинантного белка на 1 мл клеточной суспензии при плотности культуры 1

1. Richardson J.H., Edwards A.J., Cruickshank J.K., Rudge P., and Dalgleish A. G. In vivo cellular tropism of human T-cell leukemia virus type I. // J. Virol. -1990, -Vol.64, P.5682-5687. 2. Hinuma. Y., Nagata K., Hanaoka M., Nakai M., Matsumoto Т., Kinoshita I. , Shirakawa S. , and Miyoshi. Adult, T-cell leukemia: antigen in an ATL cell line and detection of antibodies to the antigen In human sera. // Proc. Natl.Acad. Sci.USA. -1981, -Vol.78, P. 6476-6480. 3. Pancake В.A., Zucker-Franklin D. The difficulty of detecting HTLV-I proviral sequence in patients with Mycosis Fungoides. // J. of Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology -1996, -Vol. 13, -No.4, -P.314-319. 4. Osame M., Usuku K., Izumo S., Ijuchi N., Amitani H., Igata A., Matsumoto M., and Tara M. HTLV-I associated myelopathy, a new clinical entity. // Lancet - 1986, 1:1031-1032. 5. Mochizuki M., Ono A., Ikeda E., Hikita N., Watanabe Т., Yamaguchi K., Sagawa K. , and Ito K. HTLV-I uveits. // J. of Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology. - 1996, -Vol. 13, -No.1, P. 50-56. 6. Yamashita M., Ido E., Miura Т., and Hayami M. Molecular epidemiology of HTLV-I in the world. // J. of Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology. -1996, -Vol.13 - No.1, -P. 124-131. 7. Сенюта. Н.Б., Степина В.Н., Гурцевич В.Э., Мазурин B.C., Яковлева Л. С. Антитела к вирусу Т-клеточного лейкоза человека в сыворотках крови у жителей Сахалина и Южно-Курильска. // Экспериментальная онкология -1988, Т.10, Н.2, C.37-38. 8. Gressain A. , Malet C. , Robert-Lamblin J., Lepera A., David P., Chichlo B., Sousova O., Stepina V., Gurtsevitch V., Tortevoye P., Hubert A., de The G. Serological evidence of HTLV-I but not HTLV-II infection in ethnic groups of Northern and Easten Siberia. // J. of Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology. -1996, -Vol. 11, -No.4, P.413-414. 9. Seiki M., Hattori S., Hirayama Y. and Yoshida M. Human adalt T-cell leukemia virus: complete nucleotide sequence of the provirus genome integrated in leukemia cell DNA. // Proc. Natl. Acad.Sci. -1983. -Vol.80, -P. 3618-3622. 10. Маниатис Т. , Фрич Э. и Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Пер.англ. -М., 1984. 11. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. - 1970, -Vol. 227, -No.5259, -P. 680-685.
Формула изобретения


2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pATLG 579 размером 5,9 т.п.н., содержащая BamY-II-Clal фрагмент вектора pUR 290 и кодирующая полипептид G579 с молекулярным весом 145 кДа, предназначенный для определения антител к вирусам Т-клеточного лейкоза человека I и II типа, состоящий из бета-галактозидазы, двух аминокислотных остатков Ser и Val, кодируемых полилинкерной областью, и вирусспецифической части, кодируемой геном gag, содержащим фрагмент по п.1. 3. Штамм бактерий Escherichia coli HB101/pATLG 579 - продуцент полипептида G 579, предназначенного для определения антител к вирусам Т-клеточного лейкоза человека I и II типа.
РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2