Способ флуоресцентного иммуноанализа

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к способам проведения иммуноанализа , и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, промышленности для определения биологически активных соединений Целью изобретения является повышение чувствительности лантанидного флуоресцентного иммуноанализа. Введение ионов европия в конъюгат, представляющий собой антитела, связанные с хелатирующим агентом, производят после осуществления иммунной реакции в концентрации 2 ,4 М в ацетатном 50-100 мМ буфере с рН 4,5-5,5 и инкубируют в течение 20-60 мин. Таким образом, достигается чувствительность в определении МКАТЕю 6 М, прототип имеет чувствительность 1,26 М.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/533

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4600199/14 (22) 31.10,88 (46) 15.04.91. Бюл. N 14 (71) Институт биохимии им. А.Н. Баха и Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (72) А.П. Савицкий, И,В. Пономарева, К.Л. Шаханина и А.А, Щеголев (53) 615.375 (088.8) (56) Betterson К, et al. Clin. Chem., 1983, vol, 29, р. 60-64. (54) СПОСОБ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам проведения иммуИзобретение относится к биотехнологии, в частности к способам проведения лантанидного флуоресцентного иммуноаналиэа, и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, микробиологической промышленности, а также в научных исследованиях для определения биологически активных соединений.

Цель изобретения — повышение чувствительности способа.

Способ осуществляют следующим образом, Для приготовления иммуносорбента на полистирольную поверхность сорбируют антиген или антитело, насыщают сорбент инертным белком (БСА). Инкубируют иммуносорбент с анализируемыми пробами, Вносят специфический конъюгат (антитело— хелатирующий лиганд), инкубируют. После промывания добавляют Еи в концентрации 10 — 10 М в цитратном (10 — 10 M), БЦ,Ä 1642400 А1 ноанализа, и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, промышленности для определения биологически активных соединений. Целью изобретения является повышение чувствительности лантанидного флуоресцентного иммуноаналиэа, Введение ионов европия в конъюгат, представляющий собой антитела, связанные с хелатирующим агентом, производят после осуществления иммунной реакции в концентрации 2 10 — 2,4 10 М в ацетатном 50-100 мМ буфере с рН 4,5 — 5,5 и инкубируют в течение 20 — 60 мин. Таким образом, достигается чувствительность в определении МКАТ Е1о б 10 М, прототип имеет чувствительность 1,26 10 M. или ацетатном (50 — 100 мМ) буфере, рН 4,55,5. Инкубируют в течение 20 — 60 мин при комнатной температуре, избыток удаляют, твердую фазу обрабатывают промывным «д раствором, содержащим 10 — 10 М ДТРА (р,, или ЭДТА в течение 2 — 10 мин при комнатной температуре. После промывания добавляют усиливающий раствор, перемешивают на встряхивателе в течение 10-15 мин, из- + меря ют флуоресцен цию Е и на флуорометре С с временной дискриминацией сигнала. О

Пример. Определение моноклональных антиинсулиновых антител.

На полистирольные микропланшеты (Ef lab, Helsinki), иммобилизовали инсулин (10 мкг/мл) в 100 мкл 0,1 М карбонатнрго буфера, рН 9,2 (буфер N 1), инкубировали в течение ночи при комнатной температуре, Выполняли трехкратное промывание .раствором, содержащим 9 г/л NaCI и 0,5 г/л

Йайэ. Насыщали полистирольную поверх1642400

20 Формула изобретения

Составитель Е.Васильева

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор M.Ìàêñèìèøèíåö

Редактор А.Огар

Заказ 1145 Тираж 419 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035„Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ность БСА (5 г/л) в 250 мкл буфера ¹ 1 в течение 2 ч при 37 С, После трехкратного промывания наносили по 100 мкл антиинсулиновых моноклональных антител (МКАТ)

Е<о, предварительно разведенных в буфере № 2, содержащем 50 мМ трис-HCI, 9 г/л

NaCl, 0,5 г/л ИаИЗ, 5 г/л БСА, 0,5 г/л бычьего глобулина, 1мл/л твина 20, в диапазоне концентраций 10 — 10 М, инкубировали

1 ч при 37 С. Лунки трижды промывали и вносили специфический коньюгат, кроличьи антимышиные антитела (КАМ) — диэтилентриаминтетраацетат (ДТТА) — E u, 6 мкгl мл, в буфере № 2, дополнительно содержащем

10 M ДТРА и 5 х 10 M CaClz, по 100 мкл, инкубировали в течение 1 ч при 37 С, После трехкратного промывания добавляли усилив а ющий раствор (LK B — Wa l 1 ac), 100 м кл, перемешивали на встряхивателе в течение

10 мин, измеряли флуоресценцию на флуорометре "Arcus 1230". В контрольных лунках анализ воспроизводили без этапа нанесения MKAT Ет. Минимальная концентрация МКАТ Е1о, при которой сигнал опыта в 2 раза превосходил сигнал контроля, составила 1,26 х l0 М, После приготовления иммуносорбента, нанесения МКАТ Е>о аналогично описанному наносили специфический конъюгат, КАМ—

ДТТА, 6 мкг/мл, по 100 мкл в буфере ¹ 2, дополнительно содержащем 10 М ДТРА и

5 х 10 М СаС12, инкубировали 1 ч при 37 С.

После трехкратного промывания добавляли

EuCtz (6,6 х 10 M) в 100 мкл 75 мМ ацетатного буфера, рН 5,0, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Обрабатывали твердую фазу промывным раствором, содержащим 10 М ДТРА и 10 M

СаС1, в течение 5 мин при комнатной темпе5 ратуре, затем промывали 3 раза. Добавляли усиливающий раствор (100 мкл), перемешивали на встряхивателе в течение 10 мин, измеряли флуоресценцию на флуорометре

"Arcus 1230". В контрольных лунках анализ

1Î воспроизводили без этапа нанесения МКАТ

Е о. Минимальная концентрация MKAT Eto, при которои сигнал опыта в 2 раза превосходил сигнал контроля, составила 6 х 10 M.

Предлагаемый способ флуоресцентного

15 иммуноанализа позволяет определять

МКАТ Е1о в концентрации 6 10 M, в то время как известный способ имеет чувствительность 1,26 10 М.

Способ флуоресцентного иммуноанализа, включающий взаимодействие иммуносорбента,. исследуемого образца и

25 меченного Åuз конъюгата с хелатирующим агентом с последующей оценкой иммунной з+ реакции по Еиз, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности з+ способа, введение ионов Еи в коньюгат

30 осуществляют после взаимодействия реагентов в концентрации 2 10 — 2,4 10 М в ацетатном 50 — 100 мМ буфере с рН 4,755,5 и инкубируют в течение 20 — 60 мин.