Способ определения специфической флуоресценции лимфоидных клеток крови

 

Изобретение относится к иммунологии . Цель изобретения - повьппение точности и ускорение способа определения . Лимфоидные клетки крови инкубируют и после отмывания суспензируют . Клеточную взвесь после нанесения на стекло инкубируют. Мазок подсушивают , окрашивают фпюорохромированной аитисывороткой и проводят измерение клеточной флюоресценции и светорассеяния. Чувствительность способа повышается в 1,4 раза. оо 1C 00 СП |

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„,SU„„1328757

А1

15ц 4 G 01 N 33/533

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3907765/28-14 (22) 11.06.85 (46) 07.08.87. Бюл. У 29 (71) Киргизский государственный медицинский институт (72) Е,В.Бененсон и Е,Г.Цай (53) 615.375 (088.8) (56) Levin А. - Апп. NY Асад, Sci.

1971, 177, р. 481-489. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ

ФЛ1ООРЕСЦЕНЦИИ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК КРОВИ (57) Изобретение относится к иммунологии, Цель изобретения — повьппение точности и ускорение способа определения. Лимфоидные клетки крови инкубируют и после отмывания суспензируют. Клеточную взвесь после нанесения на стекло инкубируют. Мазок подсушивают, окрашивают флюорохромированной антисывороткой и проводят измерение клеточной фпюоресценции и светорассеяния. Чувствительность способа повьппается в 1 4 раза.

1 13287

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии.

Цель изобретения — повышение точности и ускорение способа определения...

Способ осуществляется следующим образом.

Лимфоидные клетки крови из разных источников (свежевыделенные клетки крови, клетки из культур ткани) инку- 10 бируют 30 мин при комнатной температуре в 2,5%-номрастворе ЭДТР, в котором содержится метиорлат 1:10000, и затем трижды отмывают этим же раствором. После последнего отмывания клет- 15 ки суспензируют в одной капле раствора ЭДТА и каплю клеточной взвеси наносят на чистое, хорошо обезжиренное предметное стекло.

Предметное стекло с нанесенной 20 каплей клеточной взвеси инкубируют

3 мин во влажной камере, затем стекло несколько pas проводят над пла енем горелки и погружают ребром в сосуд с водопроводной водой для удаления неприкрепившихся к стеклу клеток. Полученный мазок несколько раз промывают водопроводной водой, подсушивают на воздухе и окрашивают флюорохромированной антисывороткой 30 против излучаемых иммуноглобулинов„

Рабочее разведение антисыворотки и время скрашивания подбирают в предварительных опытах.

После скрашивания препараты про- 35 мывают в водопроводной воде, высуши4. вают, после чего они готовы для исследования. Изучение окрашенных клеточных препаратов проводят в цито-, флюориметре типа„ Люмам-И ° Перед 40 исследованием из цитофпюориметра убирается один из микрозондов для того, чтобы обеспечить измерения не с участка, ограниченного размерами микрозонда, а со всего участка кле- 4б точного препарата, находящегося в .поле объектива.

При измерении зеленой фпюоресценции с максимумом излучения 530 нм устанавливают следующую систему возбуждающего освещения: светоделительная пластинка темного поля, возбуждающие фильтры СЭС 24-4, ФС 1-4; эпиобъектив 21 0,40; вместо запирающего фильтра в цитофлюориметре устанавливается интерференционный светофильтр с максимумом пропускания, соответствующим максимуму флюоресценции 530 нм (фильтр И 8 в ЦФМ "Люмам-И") .

При измерении светорассеяния с максимумом излучения 410 нм (возбуждающий светофильтр ФС-1-4) используется интерференциональный фильтр с соответствующим максимумом пропускания 410 нм (фильтр Б- 3 в ЦФМ "ЛюмамИ-3"). Кроме того, в возбуждающую систему дополнительно вводится для ослабления интенсивности светового потока матовый светофильтр (МС 13-2).

Измерения проводят в следующем порядке.

Убирают один из микрозондов флюориметра. Устанавливают возбуждающее освещение сверху и регулируют его и темнопольный вариант, Устанавливают поворотом диска интерференционный светофильтр Р 8. Устанавливают на предметный столик с-.,екло с окрашенными клетками и наводят резкость (эта операция выполняется с одним из оставшихся микрозондов цитофлюориметра), Поворотом диска устанавливают положение, соответствующее убранному микрозонду, Открывают диафрагму фотоэлемента, снимают показания ре" гистрирующего прибора, Измерение суммарной флюоресценции закончено.

В систему возбуждающего освещения вводят матовый светофильтр. Поворотом диска устанавливают интерференционный фильтр N - 3. Открывают диафрагму фотоэлемента, снимают показания регистрирующего прибора. Измерение суммарного светорассеяния закончено.

Величину суммарной флюоресценции

/1./ делят на величину светорассеяния /L/. Полученная величина /C>/ соответствует средней внутриклеточной концентрации изучаемого нммуноглобулина.

В системе возбуждающих фильтров добавляют матовый светофильтр МС13-2.

Устанавливают интерференционный светофильтр Р 3, открывают диафрагму фотоэлемента. На регистриру :;щем приборе показания 0,579 В, Суммарную Величину флюоресц-.нции

0,221 В делят на суммарную величину светорассеяния 0,579 В. Средняя внутриклеточная концентрация иммуноглобулинов составляет 0,382, Пример„ Больная Г. Диагноз: бронхнальная астма, Лимфоидные клетки крови выделяют путем центрифуги13

Составитель В,Фролова

Редактор П.Гереши Техред М.Ходанич

Корректор А.Зимокосов

Заказ 3480/48 Тираж 776 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д,4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r.Óæãoðoä, ул.Проектная,4 рования в градиенте плотности фиколверографин, инкубируют 30 мин при комнатной температуре в 2,57.-ном растворе ЭДТР, содержащем метиорлат

1:10000, и трижды отмывают в этом же растворе. Клеточный осадок ресуспензируют в одной капле промывающего раствора и каплю взвеси наносят на предметное стекло. Стекло инкубируют 3 мин во влажной камере.при комнатной температуре, после чего стекло несколько раз проводят над пламенем горелки и погружают несколько раз ребром в сосуд с водопроводной водой. На месте капли остается

° четко заметное клеточное пятно, После просушивания на клетки наносят одну каплю антиглобулиновой люминисцирующей сыворотки в разведении 1:3 (рабочий титр на этикетке

1:16), инкубируют 30 мин во влажной камере при комнатной температуре, погружают на 10 мин в водопроводную воду, подсушивают и проводят измерения клеточных флюоресценции и светорассеяния, Из цитофлюориметра убирают микрозонд 0,1 мкм. Возбуждающее освещение сверху устанавливают по методу темного поля, Фильтры СЗС вЂ” 24-4;

ФС-1-4, Интерференционный фильтр У 8 эпиобъектив темного поля 21к0,40, ток лампы 4 А.

Устанавливают один из сохранившихся микрозондов (0,5 мкм) и наводят

28757 4 резкость на изображении участка окрашенного препарата. После этого устанавливают положение соответствующее убранному зонду (0,1 мкм), и открывают диафрагму фотоэлемента. На регистрирующем приборе показания 0,221 В, Поставленная: цель достигается тем, что .известным способом увеличение внутрикисточной концентрации иммуноглобулинов определяют в 707. случаев, с помощью предлагаемого способа — в 100Х т.е. чувствительность предлагаемого способа в 1,4 раза вьппе, при этом время на выполнение измерений в 20 раз меныпе, Формула изобретения

Способ определения специфической флюоресценции лимфоидных клеток кро- ви, включающий окрашивание клеток специфическими антителами, связанны25 ми с флюорохромом и имерение флюоресценцин под микроскопом .с помощью флюориметра, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа, измерение фпюоресценции осуществляют при малом увеличении, дополнительно устанавливают величину светорассеяния и определяют специфическую флюоресценцию лимфоидных клеток по отношению величины флюоресценции к светорассея35 нию,