1 (22) 21. 02. 89 (46) 28. 02. 91. Бюл. Р 8 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Научно-исследовательский институт лекарственных средств и Химико-фармацевтический комбинат "Акрихин" (72) В.Н.Крылов, А.С.Яненко, Е.В.Фрейзон, В.З.Ахвердян, Б.И.Демченко, В.И.Тропина, Н.И.Кисленко, Н.В. Домрачев, А.Н.Ммаков, Е.M.Âàéñìàí, Г.И.Коновалова, В.В.Козельский, Т.веЧервяк и Э.Ф.Умнова (53) 576.8:577.17.02{088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N - 578334, кл. С 12 P 33/00, 1976.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологической трансформации стероидов.

Цель изобретения вЂ” создание штамма, устойчивого к фагу РСМ.

Штамм Corynebacterium mediolanum

СМ-А311 получен путем многоступенчатой селекции на устойчивость к фагу

РСМ из штамма С.mediolanum В-964.

Штамм СМ-А311 депонирован под номером ВКПМ Р В-4657 и характеризуется следующими признаками, Куль тур аль но-морфологические признак и.

Молодые клетки палочки размером

0,3-0,4х1,6-1,8 мкм, изредка соеди2 (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ CORYNEBACTERiK1

NEDIOLANUIt, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЦЯ ТРАНСФОРМАЦИИ СВОВОДНИХ ИЛИ АЦИЛИРОВАННЫХ

3 Р-ОКСИ-6 -СТГРОИДОВ В 3-КВТО-ЛАСТЕ Р01ЛДЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологической трансформации стероидов. Цель изобретения вЂ” создание штамма, устойчивого к фагу РСМ. !Лтамм получен путем многоступенчатой селекции на устойчивость к бактериофагу РСМ из штамма-прототипа Corynebacterium тейхо1anum В-964 и депонирован од номером ВКПМ Р В-4657. Штамм хорошо растет на производственных средах, устойчив к бактериофагу РСМ в концентрации 10 и/мл, активно траноэор6 мирует стероидный субстрат. Выход целевого продукта составляет 77-88, 237 от внесенного стероида. ненные концами. Старые клетки представляют собой кокки размером 0,40,5õ0,5-0,65 мкмо Спор не образует, неподвижные.

Мясопептонный агар. На 3-и сутки роста при 300С штамм образует круг- . лые колонии диаметром 3-5 мм с ровными краями, форма выпуклая, конусообразная с выраженной вершиной„ цвета слоновой кости при выдерживании в темноте и лимонно-желтого цвета на свету, пигмента в среду не выделяет, консистенция маслообразная, суспензия в воде равномерная.

Агаризованная среда СМ-6. Д-глюкоза 3 r, дрожжевой автолизат 6 г, К НРО . 1,8 г, Na HPO x 12 Н О 4 г, 1631087

NaCl 2 r, дистиллированная вода до

1 л, агар 15 г, рН 7,3-7,4, рост анаЛогичен росту на ИПа.

Агаризованная среда Хоттингера: рост штамма аналогичен росту на ИПА.

Физиолого - б и о х и м ические свойства.

Молодые клетки грамотрицатепьные, старые клетки грамположительные.

Аэроб для оптимального роста требует интенсивной аэрации.

Рост культуры происходит в интервале температур от 20 до 37 С, в интервале рН от 5,5 до 9,5. Оптимальный рост культуры происходит при

33 С. Культура хорошо растет при рН

6,8-7,2, оптимум рН составляет 7,0.

Отношение к источникам азота: усваивает азот в форме мочевины, 20 сульфата аммония, аргинина.

Отношение к источникам углерода: ассимилирует глюкозу, сахарозу, ксилозу, манозу, арабинозу.

Фагоустойчивость: в присутствии 25

10 частиц фага нормально развивается и осуществляет процесс трансформации °

Штамм хранят в лиофилизированном состоянии в течение 1 г.

Использование штамма СМ-А311 иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Использование штамма С.mediolanum CM-А311 для. трансформации моноацетата вещества

R в вещество S Рейхштейна в присут35 ствии фага PCM.

Трансформационную активность

СИ-А311 оценивают в сравнении со штаммом-прототипом В-964 в одинако40 вых условиях. Для получения рабочих культур оба штамма, хранящихся в лиофильнО высушенном состОянии 9 BbI ращивают стерильно в течение двух пассажей по 30 ч при Т = 33 С в пробирках на скошенных столбиках агари45 зованной питательной среды PS (пептон 4,5 r дрожжевой экстракт 3 r гидролизат казеина 4 r, мясопептонный бульон 150 мл, глюкоза 1 r агар

0,20 г, .вода до 1 л, рН 6,9-7,0).

Затем осуществляют в стерильных условиях накопление посевного материала, в конических колбах объемом

500 мл со 100 мл жидкой питательной среды CN б. Для этого рабочую культу- 55 ру с поверхности скошенных столбиков, агаризованной среды PS смывают 5 мл физиологического раствора и по 0,5 мп полученной суспензии засевают CN-6 в двух колбах, в которых выращивают

1 генерацию культур в течение 24 ч при 33 С на круговой качалке с

220 об/мин.. Полученную культуру в количестве 0,6% используют в качестве посевного материала для выращивания II генерации культур на среде

CN-б в аналогичных условиях, Полученную культуру в количестве

7,5% (объемных) используют для выращивания трансформационной культуры в колбах объемом 500 мл со 100 мл питательной среды ВК-4К (кукурузный экстракт 8 г/л„ Ма НРО х 12 Н О

4,65 г/л, КН ГО4 1 г/л, рН 7,1) при

33 С в течение 16 ч и параллельно в лабораторных ферментерах с 5 л питательной среды ВК-4К в присутствии индуктора, в качестве которого используют 0,1 г/л стероидного субстрата в тех же условиях. В колбы параллельно с культурой добавляют фаг PCN в конечной кон .ентрации 1,5х10 ч./мл

6 (в качестве контроля в одну из колб со штаммом-про:отипом фаг не добавляют). Контроль за ростом культур осуществляют по изменению рН и оптической IIJlогности культуральной жидкости {предварительно разведенной в 10 раз), Для проведения трансформации стероидный субстрат, предварительно размельченный до размеров частиц

5-15 мкм, вносят по 250 мг (5 г/л) в колбы и по 50 r (10 г/л) в ферментеры. В колбу со штаммом-прототипом, выращенным в присутствии фага РСМ9 стероид не вносят, так как культура полностью лизирована с ооразованием фага в концентрации 10" ч./мл. Трансформацию проводят в тех же условиях, что и выращивание культур под контролем процесса трансформации.

Содержание целевого продукта в культуральной жидкости при использовании штамма CM-А311 в присутствии фага PCM составляет 4,27 г/л (выход

85,4% от загруженного NAR), а при использовании штамма-прототипа в отсутствии фага вЂ” 4,23 г/л (84,6%), так как в присутствии фага штаммпрототип лизируется полностью.

Процесс трансформации заканчивается через 1.3 ч как у штамма CM-A311, так и у .штамма-прототипа. Выход конечного продукта при использовании штамма CN-A311 составляет 38,20 г вещества Рейхштейна (76,4% от загруСоставитель Г. Смирнова

Техред Л.Сердюкова Корректор Л. Пилипенко!

Редактор M. Келемеш

Заказ 524 Тираж 362 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГЕНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

5 163 женного субстрата), а при использовании штамма-прототипа вЂ” 38,05 r ! (76,1Х от загруженного субстрата).

При использовании СМ-А311. удельныи показатель поглощения Е,ч при

< о длине волны 241 нм составляет 458,5; т.пл. 211 С, потери в весе при высушивании 0,25Х; хроматографическая чистота меньше 1 примесей (под УФ) и следовые количества (при опрыскивании хроматограмм серной кислотой).

При использовании штамма-прототи, d/ па В-954: Е о. 467,7, т.пл. 209 С, потеря в весе при высушивании 0,35Х, хроматографическая чистота 1Х примесей (под УФ) и следовые количества (при опрыскивании хроматограмм серной кислотой).

Пример 2. Использование штамма С.mediolanum g4-À311 для трансформации вещества R в вещество

S Рейхштейна в присутствии фага PCM.

Трансформационную активность штамма СМ-А311 оценивают в сравнении со штаммом-прототипом. Выращивание культур и процесс трансформации осуществляют так же, как описано в примере 1. В качестве субстрата используют вещество R Фейхштейна (5-прегнен-3Р, 170(, 21-триол-20она). Загрузку вещества К производят в концентрации 4 г/л культуральной жидкости в

1087 6 виде водной суспензии. Добавление фага РСМ производят в колбы до конечной концентрации 1,5х10 ч/мл аналогично тому, как описано в примере 1, Трансформация проходит полностью за

10 ч, как в случае штамма СМ-А31 1, так и в случае штамма-прототипа в отсутствии фага PCM-15,5 r (7?,2Х от загруженного вещества R) В случае выращивания штамма-прототипа в при- . сутствии фага PCM наблюдается полный лизис культуры.

Таким образом, штамм-трансформатор CM-À311 (BKIIM В-4657), сохраняя высокую трансформационную активность как по времени трансформации, так и по выходу целевого продукта, устойчив к фагу PCII выделенному в

20 производственных условиях, что позволяет сократить число фаголизисных операций, приводит к экономии сырья„ электроэнергии, трудозатрат. Использование штамма обеспечивает стабиль"

25 ность и рентабельность производственного процесса.

Формула изобретения.

Штамм бактерий Corynebacterium

30 mediolanum ВКПМ Р Б-4657. используемый для трансформации свободных или ацилированных 3 -окси-Р --стеро6 идов в 3-кето-Ь -стероиды.