Способ получения эндонуклеазы рестрикции н @ а i

 

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, в частности к производству ферментов из микробных клеток, а именно к способам получения эндонуклеазы рестрикции HHA 1 из биомассы HAEMOPHILUS HAEMOLUTICUS, и может быть использовано в генной инженерии. С целью упрощения процесса и повышения качества целевого фермента исходную биомассу HACMOPHILUS HAEMOLUTICUS ВКПМ В-4070 разрушают ультразвуком. Полученный клеточный гомогенат фракционируют в двухфазной системе, содержащей 7%-ный полиэтиленгликоль и 2%-ный декстран в присутствии 38-45 мМ NACL при PH 7,6, верхнюю полиэтиленгликолевую фазу, содержащую целевой фермент, наносят на колонку с фосфоцеллюлозой Р11, а элюцию белков проводят линейным градиентом концентрации NACL от 0,2 до 1,0 М в буфере. Выход рестриктазы HHA 1 составляет 4-6 тыс. ед. акт/г биомассы с концентрацией 25 тыс. ед. акт/мл. В готовом продукте примесей нуклеаз не обнаруживается при обработке ДНК 15-кратным избытком фермента в течение 20 ч.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 44 71816/30-13 (22) 06.06.88 (t6) 15. 12.90, Бюл. 11 46 (71) ita "ч но -исследовательский констрзкто1 сKo тех >ологический институт биологически а ктивньгх веществ (72) Н.И.Пустопп лова и Н.В.В1ингарева . (53) 577. 15. 08. 155. 2 (088.8) (56) Биотехнология, 1986, 1з 1, с. 26—

30 °

J . Ио1 . Biol . 19 76, v. 103, р. 199 †2. (54) СПОСОБ ПОЛУ 1ЕНПЯ ЭНДОНУКЛ1.АЗЫ

Р ЕС ТРИ КЦИР Н1>а I (57) Изобретегп е относится к биохи-. мии и биотехнологии, в частности к производству ферментов из «п кробных клеток, а именно к способам получе— ния эндонуклеазы 1:- стрикпии Н»а 1 из б;to>taccbt Haemophilus haemolytitus, и мо>.;ет бь ть использовано в геши>й инИзобретение относится. к технической биохимии и биотехнологии, в частности к производству ферментов иэ микробных клеток, и может быть исполь зовано для различных молекулярнобиологических и генноинженерных ра— бот.

11елью изобретения яв"ястся упрощение процесса и новышения качества целевого продукта.

Способ ос уществляют сл едующим образом.

Биомассу Haemophiltt.; hat..molyticus (ВКПИ В-4070) разрушают с помощью ультразвука, за гем к клеч очному гомогенату доба вляют концентрированну а с

„„SU„„1613490 A 1

Ц1) CN 9/22 (С 12 N 9/22, С 12 R 1:21) 2 женерии. С целью упрощения процесса и повьппения качества целевого фермента ttcx<>!>tty биомассу Nalmophilus haemol yt icus В1«ПИ В-4070 разрушают ультр,> звуком, Полученный клеточный rомогенат фракционируют в двухфазной системе, с одержащей 72-ный полиэтиленгликоль и 2_#_-ный декстран в присутствии 38-45 мИ 11аС1 при рН 7,6, верхнюю нолиэтиленгликолевую фа зу, содер>ttatttyt> целевой фермент, наносят на колонку с фосфоцеллк>дозой Р!1, а элюцию белков проводят линейным градиен <>«концентрации NaC1 от 0,2 до

1,0 И в буфере. Выход рестриктаэы

ННа I составляет 4-6 тыс. ед. акт/г биомассы с концентрацией 25 тыс. ед . а кт/мл . В готовом продукте примесей нуклеаз не обнаруживается при обработке ДН1 15-кратным избьггком фермента в течение 20 ч . с месь поли этил е нгли коля и декс тра на в калийфосфатном буфере рН 7,6, до конечной концентрации в смеси полиэтиленгликоля 7,01, декстрана 2,07 и

NaC1 до концентрации 38 — 45 мИ. После тщательного перемешивания смесь центрифугируют при 5 — 10000 g в течение 10 — 20 мин, верхнюю полиэтиленгликолевую фазу, содержащую целевой продукт, собирают, разбавляют буфером и наносят на колонку с фосфоцеллюлозс > Р11. Проводят элюцию. белков линейным градиентом концентрации

NaC1 от 0,2 до 1,0 11 в буфере. Фракции, содержащие эндонуклеазу Hha Е, собирают и концентрируют диализом

3 1613490

4 против 507.-ного раствора глицерина в буфере. Выход фермента из 10 r клеток 40 — 60 тыс.ед.акт. Хранится прео парат при температуре минус (20+2) С

5 в течение 12 мес без снижения активности. Свободен от значительных примесей неспецифических нуклеаз: обра— ботка ДНК фага ф не менее чем 15кратным избыткои фермента в течение д штельного времени (17 — 20 чj при

37 С пе изменяет специфической картины гидролиза.

Пример 1. Все операции по очистке фермента проводят при (4 4) С. !5

Актицц сть рестриктазы Hha I тестируют методом гидролиза ДНК фага ф в типичных условиях с последующим разделением полученных фрагментов электрофоре ои в 1,8Е-ной агарозе.

За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного специфического гидрочиза 1 мкг ДНК(фага 71 в течение

1 ч при (37+1) С.

10 г замороженной биомассы Haemoph il us haemol yt icu s ВКПИ В-4070 суспендируют в 20 мл 10 мИ калийфосфатного буфера рН 7,6, содержащего 7 мИ

2-меркаптоэта нол, О, 1 мИ ЭДТА (буфер Л), добавляют тритон Х-100 до конечной концентрации О, 17 и обрабатывают ультразвуком при 20 кГц и амплитуде (17+2) мкм в течение 45 с

10 раз с интервалом 45 с для охлажде35 ния смеси. К клеточному гомогенату при постоянном перемешивании на магнитной мешалке приливают 30 мп смеси, содержащей 217 полиэтиленгликоля и

61 декстран, 3,45 мл 1 м раствора 40

NaC1 (до конечной концентрации 38 мИ) и 26,55 мл деионизованной воды, Смесь продолжают перемешивать в течение

15 мин, затем центрифугируют при

5000 об/иин в течение 20 мин. Верх- 45 нюю фазу отбирают, разбавляют в 2, 5 раза буфером А и наносят на колонку с фосфоцеллюлозой Р11 (1,5к30) см, уравновешенную буфером А. Колонку промывают 50 мл 0,2 М NaC1 в буфере

А, фермент элюируют линейным градиентом концентрации NaC1 от 0,2 до

1,0 И в буфере А. Общий объем градиента 200 ил. Скорость нанесения на колонку, промывки и элюции 20 мл/ч.

Собирают фракции IIO 5 ил и анализируют на активность рестриктазы Hha I, отбирают аликвоты для испытания объемом 5 мкл, Фракции, rop,åðæàöèe целевой продукт, которые элюируются в диана оно концентраций NaC1 0,52

0 62 И, обч елин: т (V = 25 мл), перенг лт в диали цып мс шок и диализуют против 300 — 350 мл 507.— ного раствора глицерина в буфере А. Время диа— лиза 14 — 17 ч. Выход фермента с операции 60000 ед.акт. Концентрация фериента 15 тыс.ед.акт,/ип. Полученный препарат эндонуклеаэы рестрикции

Hha I хранят при (-20) С в течение

12 мес без снижения активности, Содержание примесей неспецифических нуклеаз н препарате оценивают двумя методами: обработкой ДНК hara избьггками фермента в течение длительного времени и ме годом рестрикция-лигирование-повторная рестрикция. Установлено, что при обработке 1 мкг ДНК фага ф 15 ед.акт, препарата рестриктазы вайа I (15-кратным нзбьггком) в течение 20 ч при 37 С не изменяется четкая специфическая картина гидролиза. Фрагменты, получаемые при обработке 1 мкг ДНК фага 3 ед.акт. препарата }Iha I в течение 17 ч при о

37 С, линируются ДНК-лига зой Т4 не менее чеи на 90Е и полностью специшически гидролизуются при обработке препаратом Hha I.

Пример 2. Эцпонуклеазу рестрикции НЬа I выделяют из 10 г клеток аналогично примеру 1 за исключением того, что к клеточному гомогенату приливают 4,5 мл 0,9 И NaC1 (до конечной концентрации 45 иИ) и 25, 5 мп деионизованной воды. Выход препарата фериента из 10 г 48 тыс. ед.акт.

Четкая специфическая картина гидролиза наблюдается при обработке

1 икг ДНК фага ) 15 ед.акт. препарата в течение 17 ч при 37 С.

Фрагменты, полученные при обработке 1 мкг JIHK |hara 6 ед.акт. препарата в течение 17 ч при 37 С лигируюто ся ДНК-лигазой Т4 íà 90 . и полностью специфически гидролизуются при обработке препаратом рестриктаэы Hha I. р и 1 е р 3. Эндонуклеазу рестрикции Hha I выцеляют из 10 г клеток аналогично примеру 1 за исключением того, что к клеточному гомогенату приливают 4,5 ил 1 И NaC1 (до конечной концентрации 50 мИ) и 25,5 мл деионизованной воды. Выход препарата фермента из 10 r клеток 48 тыс.ед,акт. с концентрацией 9,5 тыс,ед.акт./ил.

Сос та вит ель В. Варламов

Редактор O. Спеси вых Техр ед М. Дидык Корректор И.Эрдейи .

Заказ 3867 Тираж 478 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

5 16

При обработке 1 мкг ДНК фага ф

10 — 13 ед.акт. препарата в течение

17 ч при 37 С четкой картины рестрикции не наблюдается, полосы фрагментов размыты, что указывает на наличие заметных примесей эндонуклеаз.

Пример 4. Эндонуклеазу рестрикции Hha I выделяют из, 10 г клеток аналогично примеру 1 за исключением того, что к клеточному гомогенату приливают 3,5 мп 0,9 M NaC1 (до конечной концентрации 35 мИ) и 26,5 мп деиониэованной воды. Выход препарата фермента из 10 г клеток 30 тыс, ед . а кт . с концентрацией 8000 ед/мл . Примеси неспецифических эндонуклеаз, экзонукпеаз и фосфатаз в препарате не обнаруживаются.

13490 6

Фор мула из обретения

Способ получения энпонуклеаэы рестрикциии Hha I, пр едусматри вающи и разрушение биомассы продуцента Haemoph ilu s haemoly t icu s ул ьтра звуком, фракционирование полученного клеточного гомогената, хроматографию на фосфоцеллюпозе Р11 и диализ, о т личающийся тем,что,сцелью упрощения процесса и повышения качества целевого фермента, в качестве продуцента используют штамм

Haemophilus haemolyticus ВКПИ В4070, фракционирование клеточного гомогената проводят при рН 7,6. двухфазной системе, содержащей 7..-ный полиэтиленгликоль и 2Х-ный декстран в присутствии 38 — 45 мИ ХаС1.