Способ выделения оксидазы d-аминокислоты из trigonopsis vаriавilis

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается выделения оксидазы Д-аминокислот, проявляющих активность против цефалоспорина С. Цель изобретения - повышение чистоты целевого продукта. Фермент выделяют из GRIGONOPSIS VARIABILIS способом, который проводят в 3 стадии, а именно: (а) подкисление и нагревание сырого клеточного экстракта с получением осадка и супернатанта (всплывшей фракции)

(б) обработку его сульфатом аммония в количестве, достаточном для образования второго осадка, содержащего оксидазу Д-аминокислот и (в) повторное суспендирование полученного на стадии (б) осадка и выделение изоэлектрическим осаждением. 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) 5 С 12 N 9/06

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И IlATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4028255/30-13 (86) PCT/S Е 86/00006 (10.01.86) (22) 10.09.86 (31) 8500157-6 (32) 11.01,85 (33) SE (46) 30.10 ° 90. Бюл, Р 40 (71)- Клаус Мосбах (SE) (72) Клаус Мосбах (SE) и Эстера

Швайцер (PL) (53) 577,!5 (088,8) (56) Арр1 Biochem. Biotechnol, 1981, 6, 293-308.

Патент США У 3658678, кл. С 12 N 9/06, опублик. 1972. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ОКСИДАЗЪ|

D-АМИНОКИСЛОТЫ ИЗ TRIGONOPSIS

ЧА1ПАВП ЕБ (57) Изобретение относится к биотехИзобретение относится к биотехнологии и касается выделения оксидазы

0-аминокислот, проявляющих активность против цефалоспорина С, Цель изобретения — повышение чистоты целевого продукта.

На фиг.1 приведены результаты электрофореза очищенной оксидазы

Э-аминокислот в полиакриламидном геле. Электрофорез в геле 25 r чистого белка в додецилсульфате натрия показывает только одну полосу белка (темная меньшая полоса, видимая слева указывает границу двух "оконденсированных" гелей), Добавляемую к гелям

„.Я0„„1604163 А 3

2 нологии и касается выделения оксида= зы D-аминокислот, проявляющих активность против цефалоспорина С. Цель изобретения — повышение чистоты целевого продукта. Фермент выделяют из

Trigonopsis variabilis способом, который проводят в 3 стадии, а именно: (а) подкисление и нагревание сырого клеточного экстракта с получениемосадка и супернатанта (всплывшей фракции); (б) обработку его сульфатом аммония в количестве, достаточном для образования второго осадка, содержащего оксидазу D-аминокислот и (в)повторное суспендирование полученного на стадии (б) осадка и выделение изот электрическим осаждением. 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл. метку отрезают перед подкрашиванием белка.

На фиг.2 приведены результаты определения молекулярной массы оксидазы D-аминокислот из Trigonopsis

variabilis. Электрофорез в геле с додецилсульфатом натрия (ДСН) проводят в 12%»íoì полиакриламиде согласно Laemmli(Nature, 1970, 227, 680685). Использованы следующие белковые метки: А — альбумин (66000);

0V — овальбумин (45000); Tr — трипсиноген (24000); L — лизозим (14500) °

На фиг.3 показана активность окрашивания гелей по отношению к ок1604163

20 сидазе D-аминокислот. Показанные фракции взяты со стадии Ш. Гели инкубируют: а) с цефалоспорином С; б) с D-лейцином.

Материалы.

Пероксидаза (тип N, из хрена обыкновенного), все аминокислоты, цефалоспорин С, динитрофенилгидразин и о-дианизин поставлены фирмой

Sigma (Сан-Луи, США), акриламид и

N,N -метиленбисакриламид — фирмой

Merk-Schuchardt (Мюнхен, ФРГ), N,N, г I

N,N -тетраметилендиамин, перосульфатаммония и пластинки, покрытые

0,25 мл силикагеля F, — фирмой

Merk (ФРГ), питательные среды — фирмой Difco (Дейтройт, США); кислородный электрод — фирмой Rank Broth ers

Bottisham (Кембридж, Англия).

Методики.

Аналитическое изоэлектрическое фокусирование проводят, используя системы IKB 1804-101. Используемые несущие амфолиты имеют рН в интер- 25 вале 3 5-9,5. Изоэлектрическое фокусирование проводят в соответствии с опытами фирмы IKB на амфолиновых пластинках с полиакриламидным гелем (EEAI) (IKB — Produkter AB Бромма, 30

Швеция, 1979). Железо определено с помощью атомной абсорбционной спектроскопии.

Состояние культур.

В исследованиях использованы дрожжи Trigonopsis variabilis.

Загружают большой объем культур в ферментатор емкостью 8 л. Питательная среда состоит из дрожжевого экстракта (1%), солодового экстракта (1,5%), в которые добавлено 0,2% В, L-метионина. Среду инкубируют 44 ч при 28 С. Исходную культуру помещают в косую среду, изготовленную из той же среды с добавкой 2% агара. 45

Клетки отделяют центрифугированием при 4000g в течение 30 мин, промывают и хранят в замороженном состоянии до использования. Средний выход клеток при различных ферментациях состав-50 ляет 45-50 r клеточной пасты.

Электрофорез, С аналитической целью проводят дисковый электрофорез в ПАГ так же, как в гелях с ДСН, при 8-10 С. Первоначально на трубку подают низкий ток в 2 мА до момента миграции красителя в разделительный гель, после чего ток повышают до постоянного значения 4 мА на трубку. Диаметр и длина трубок соответственно 0,8 и

9,5 см, Для локализации белка гели окрашивают красителем Coomassie

Brilliant Bluek.

Ферментативную активность на гелях обнаруживают согласно EIedrick u

Smith, причем гели окрашивают детектированием образовавшейся перекиси водорода с использованием о-дианизидина. Гели инкубируют в 0,1 M натрифосфатном буфере (рН 7,2), содержащем 5 мМ цефалоспорин С (или других аминокислот), пероксидазу (0,025%) и о-дианизидин (0,025%). Инкубирование проводят 30-60 мин до образования красновато-коричневого красителя.

Для препаративного выделения фермента разработано специальное оборудование. Диаметр стеклянной трубки

2 см, ее длина 14 см. Гель (8% полиакриламида) получают согласно Hedrick и Smith, используя в качестве буфера 0,19 Y трисглицин (рН 8,3), Верхний гель полимеризован в присутствии персульфата аммония и тетраметиленэтилендиамина, а вместо рибофпавина (количество катализатора взято согласно Laemmle Электрофорез ведут 3-4 ч при 10 С, используя в пер=: вые 30 мин ток в 20 мА, а затем ток в 40 мА.

Определение молекулярной массы.

Молекулярную массу определяют по методике Hedrick и Smith, а электрофорез в геле с ДСН проводят согласно

Laemmli. В первом случае используют метки для молекулярной массы при электрофорезе в гель неденатурированного полиакриламида (Sigma) во втором случае — метки молекулярной массы в геле с ДСН. Определение белка . проводят согласно Lovry.

Анализ активности оксидазы В-аминокислот.

Путем определения скорости потребления кислорода с помощью кислородного электрода фирмы Rank проводят испытания оксидазы D-аминокислот при 50 С в течение 5-10 мин, в тече-. ние которых не происходит денатурирование фермента. Конечный объем испытуемой смеси составляет 2 мл, из которых 1,8 мл приходится на пирофосфатный буфер (20 м1"., рН 8), 0,1 мл— на цефалоспорин С (100 мМ) и соответствующее количество фермента, необходимое для получения правильной на40

5 16041 чальной скорости потребления кислорода; 1 единица (E) соответствует поглощению 1 ммоль кислорода в 1 мин в данных условиях. Время,от времени прове- ряют активность, измеряя колометрическим методом количество образовавшейся кетокислоты с использованием

2,4-динитрофенилгидразина, а также о-дианизидинпероксидазы при 30 С.

Пример. Очистка оксидазы

D-аминокислот из Trigon opsivariabilis. Все операции проводят при

5 С.

Стадия I. Получение сырого экст. ракта, 32 ч. замороженной клеточной пасты (-20 С) оттаивают и суспендируют в 1,5 ч. буфера, содержащего 20 мМ пирофосфат натрия (рН 8,3). Клеточ- 20 ную суспензию смешивают с равным объемом сухого льда и размельчают в миксере. Оксидаза D-аминокислот извлекается вместе с другими растворимыми белками. Разрушенные клетки центрифугируют 30 мин при 12000g

Стадия II. Тепловое осаждение.

К подкисленному всплывшему на поверхность продукту со стадии I (730 мл) для защиты фермента добавляют 25 мМ Р, L-метионина.Продукт нагревают до 50 С и оставляют при этой температуре на водяной бане на

10 мин, Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием 30 мин при .1200g, после чего отбрасывают.

Всплывший на поверхность продукт диализуют в течение 1 сут против буфера, содержащего 20 мМ пирофосфат натрия (рН 8,3).

Стадия III. Осаждение сульфатом аммония.

Образец сс стадии II концентрируют продуванием теплового воздуха над мешком для диализа (содержащим обра- 45 зец) с целью увеличения количества белка на 17. Добавлением 2 М уксус-. ной кислоты значение рН образца снижают до 6,3, после чего перемешивают 1 5 ч с твердым сульфатом аМмония.

Фракцию, подсоленную 30 сульфата аммония, оставляют для образования осадка, после чего центрифугируют

30 мин при 12000g. Осадок отбрасывают, а всплывший на поверхность продукт (после доведения рН до 6)смешивают с твердым сульфатом аммония (55 ). Образовавшийся спустя 2 ч осадок центрифугируют 30 мин при 12000g и диализу63 6 ют против буфера, содержащего 20 мМ пирофосфат натрия (рН 8,3).

Стадия IV. Изоэлектрическое осаждение.

Образец со стадии III (10,3 мл) диализуют 12 ч против буфера, содержащего 25 мИ ацетат натрия (рН 5,1).

Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием 30 мин при 12000 g, )

В осадке обнаруживается следы ферментативной активности. Всплывший на поверхность продукт снова диализуют

12 ч против буфера, содержащего

0 1 M ацетат натрия (рН 4-6). В ооразовавшемся осадке обнаруживается большая часть активности оксидазы D-аминокислот, Осадок растворяют в буфере, содержащем 20 мМ пирофосфат натрия (рН 8,3), и диализуют сут-. ки против того же буфера.

Препаративный дисковый электрофорез в геле.

Образец со стадии IV используют

1 в препаративном электрофорезе в геле.

Для электрофоретического испытания используют 5 мг белка со с гадин ТЧ.

Полосу, показывающую активность оксидазы аминокислот относительно цефалоспорина С, отрезают и гомогенизируют 5 мин в гемогенизаторе марки

Potter (1000 об/мин) в буфере, содержащем 20 мМ пирофосфат натрия (рН 8,3), затем полученную суспензию центрифугируют 20 мин при 1000g

Гель промывают 3 раза равным коли- чеством буфера и всплывший на поверхность продукт концентрируют с помощью теплого; воздуха ро конечного объема в 3 мл, которые используют для дальнейших исследований.

Степень очистки оксидазы Э-аминокислот из Trigonops. svariabilis, активность, измеренная относительно цефалоспорина С, содержание белка, определенное по методике Lo>rry, приведены в таблице. . Предлагаемый способ упрощает очистку оксидазы П-аминокислот до однородного состояния. Препаративным электрофорезом в геле после изоэлектрического осаждения удаляют две дополнительные слабые полосы, наблюдаемые при электрбфорезе в геле. При этом удельная активность уменьшается с 5,8 Е/мг (см.таблицу) до 3, 8 Е/мг, Это можно объяснить частичным денатурированием, происходящим в ходе экст1604163 ракции, или потерей еще неидентифици- ки выделить из фермента флавины усперованных софакторов. ха не имели. Так, экстенсивный диаЭлектрофорез в геле полиакрилами-,лиз против КВ в кислотном растворе да в додецилсульфате натрия дает 5 в щелочной среде результата не дал. единственную полосу (фиг.1) для мо- Так же как ни трипсинизацией, ни килекулярной массы примерно 43000 пячением или экстрагированием 85 (фиг,2), Иолекулярная масса белка,ным раствором фенола не были получены составляет примерно 86000, флавины, Таким образом, оксидаза D-амино- 10 кислот в своей активной форме сущест- Чистый фермент в 20 мИ пирофосфатв е „е à молекулярной мас-, ном буфере при РН 8 3 устойчив в замосы примерно 86000 и с.двумя субъеди-,в Роженном состоянии ° Оттаивание и замораживание не ведет к потере активницами. о кое окрашивание гелей пос- 1 5 HocTH При 8 С активность падает

Ферментное окрашивание геле посочень медленно, но при комнатной темле инкубирования соответственно с ф спорином покаэы- пературе устойчивость относительно

Э-лейцином и цефалоспорином показ низка. Для увеличения тепловой устойвает только одну полосу на образце, чивости фермент иммобилизую различны полученном препаративным электрофоремя как менее 20 ми способами. Добавление 17,5 Е/мл зом в геле, в то время как менее чистый препарат (стадия ) дает (III) дает фермента, полученного после стадии о о ь после инкубиро- ТХХ, при 30 С в течение 30 мин к сетри основные полосы после инку ирофарозе В, активированной CNBr, в вания с "-лейцином и только одну по" лосу с цефалоспорином С (фиг ° 3). Это Оэ1 боратном буфере (pH 8,3) привос ие нескольких дит к постоянной активности в 7 F/мл указывает на присутствие нескольких

Формула изоб. от в Tri ono sis сефарозы. но только один из них проявляет ак->

1. Способ выделения оксидазы D-амиВь еленная оксидаэа П-аминокислот

0 нокислоты из Frigonopsis, variabilis, с активностью относительно цефалоспопредусматривающий получение сырого ина С обладает следующими свойствами., рина С облад бесклеточного экстракта, фракционироИзоэлектрическая точка фермента; вание сульфатом аммония до концентра-, п име но 4 6. Атомный абсорбционный анализ оказывае и ции примерно 30, отделение образоанализ доказывает, что фермент содервавшегося осадка, последующее фракжит 2 моль железа, что соответствует 35 ционирование сульфатом аммония до дос1 моль на субъединицу..После диализа тижения концентрации примерно 50 п отив 10 мМ этилендиаминтетрауксусотделение второго образовавшегося ной кислоты и 1 мИ о-фенантролина соосадка, содержащего целевой продукт, ответственно активнос нно активность остается неперевод его в растворимое состояние суспендированием в буфере, содержащем ет активность до 46 ц ид пирофосфат натрия, о т л и ч а ю - о а ианидом— . п и их концентрации 0,5 мм. щ и и с я тем что с целью по ыш — I для цефалоспоринаС, фенил- чистоты целевого п нированию сульфатом аммония подвер- составляет соответственно 13, 10, 76, 1

0,76 и 0,12, Образец, полученный ïoñ- ную путем подкисления бесклеточного ле препаративного электрофореза в ге- экстракта до РН 4-6, нагревания и ле при концентрации 5 мг/мл, не дает удаления осадка, а после переведения . спектра, аналогичного спектрам зави- второго осадка в растворимое состоясимых от флавина ферментов, поскольку ние оксидазу D-аминокислот собирают оксидаза аминокислот, извлеченная из изоэлектрическим осаждением. почек свиньи, проявляющая активность 2. Способ по п. I, о т л и ч а юотносительно цефалоспорина С, зависи- шийся тем, что подкисление ведут ма от FAD (P, Иакяе.о, А. Romeo, уксусной кислотой.

I.Ñ..ß. Perkin, 1972 I (P3), 2532), 3. Способ по п.l, о т л и ч а ю—

55 добавление различных софакторов фла-. - шийся тем, что перед нагреванием вина, таких как РМИ или FAD, не уве- добавляют D,Ü-метионин до конечной личивает удельную активность. Попыт- концентрации 25 мИ.

1604163

4. Способ по п.1, о т л и ч а ю " шийся тем, что перед фракционированием сульфатом аммония осуществляют диализ супернатанта против буфе5 ра с рН 8,3, содержащего 20 мМ пиро,фосфат натрия.

5. Способ по и.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что перед диализом супернатант концентрируют испарением. 10

6. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что проводят дополнительную стадию очистки оксидазы DБелок, мг/мп

Удельная акОчистка, выход, Х

Стадии об- Общая акработки тивность мг/мл тивность, Е/мг

384 3,5 0,15 1 100

308 5,6 1,О, 6,5 80

300 6,0 4,9

154 28 58

40

I

II

III (ян,), so, (30-55X)

IV (рН 4,6) аминокислоты, полученной изоэлектрическим осаждением, элекрофорезом в геле.

7. Способпо п.1, о тлич а ю— шийся тем, что иэоэлекрическое осаждение ведут диализом против буфера с рН 5,1, содержащего 25 мМ ацетат натрия, с последующим удалением осадка и диализом раствора, полученного в результате указанной стадии диализа против буфера с рН 4,6, содержащего

100 мИ ацетат натрия.

1604163

42

04 06 РО2. 2

02

Составитель А. Ульянова

Редактор Л. Пчолинская Техред М.Дидык

Корректор Л. Бескид и

Заказ 3395 Тираж 479 Подписное

BHHKIH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101