Способ оценки содержания белка в семенах зерновых и зернобобовых культур

 

Изобретение относится к биохимии растений и может быть использовано в работах по генетике и селекции зерновых и зернобобовых культур при оценке качества семенного материала. Целью изобретения является повышение чувствительности анализа и обеспечение возможности сохранения жизнеспособности проанализированного материала. Основы предложенного способа оценки содержания белка составляет новая совокупность методических приемов, включающая использование в качестве материала для анализа эндосперма зерна на стадии 3-4-дневных проростков, экстракцию его спиртом и осуществление нингидриновой реакции в оптимальных для развития окраски условиях. Указанная совокупность приемов позволяет сократить количество эндосперма, необходимое для проведения анализа до навески 20-40 мг, отбор которой из проросшего семени не сказывается на его жизнеспособности. При этом результаты оценки содержания белка в зерновых и зернобобовых культурах новым способом четко коррелируют с данными аналогичных исследований, проведенных традиционными методами, не предусматривающими возможность последующего использования проанализированных семян для получения урожая. Применение изобретения в практике селекционных работ позволит обеспечить надежный отбор высокобелковых семян без дополнительной затраты на анализ ценного посевного материала. 5 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (1)5 С 01 М 21 75

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И A BTQPCHQMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Поставленная цель достигается благодаря новой совокупности методичес-. ких приемов, включающей использование в качестве материала для анализа эндосперма на стадии 3-4-дневных проростков, экстракцию его спиртом и осуществление нингидриновой реакции в строго оПределенных, специально подобранных условиях. ла.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4419606/30-13 (22) .04.05.88 (46) 07.10.90. Бюл. 9 37 (71) Кишиневский сельскохозяйственный институт им. M. В. Фрунзе (72) В. Д. Симинел и И. Х. Киртока (53) 612.398(088.8) (56) Рядчиков В. Г. Улучшение зерновых белков и их оценка. — М.: Колос, 1987.

Овчаров К. Е. Физиология формирования и прорастания семян. M., 1966. (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА

В CEMEHAX ЗЕРНОВЫХ И ЗЕРНОБОБОВЫХ

КУЛЬТУР (57) Изобретение относится к биохимии растений и может быть. использовано в работах по генетике и селекции зерновых и зернобобовых культур при оценке качества семенного материала. Целью изобретения является повышение чувствительности анализа и обеспечение возможности сохранения жизнеспособности проанализированного материала. Основы предложенного способа оценки содержания белка составляет новая совокупИзобретение относится к биохимии растений и может быть использовано в работах по генетике и селекции зерновых и зернобобовых культур при оценке качества семенного материала.

Целью изобретения является повышение чувствительности анализа и обеспе чение возможности сохранения жизнеспособности .проанализированного материа„„SU„„1597700 А 1

2 ность методических приемов, включающая использование в качестве материала для анализа эндосперма зерна на стадии 3-4 дневных проростков, экст-: ракцию его спиртом и осуществление нингидриновой реакции в оптимальных для развития окраски условиях. Укаэанная совокупность приемов позволяет. сократить количество эндосперма, необходимое для проведения анализа до навески 20- 40 мг, отбор которой из проросшего семени не сказывается на его жизнеспособности. При этом результаты оценки содержания белка в зерновых и зернобобовых культурах новым способом четко коррелируют. с данными

Ф аналогичных исследований, проведенных традиционными методами, не предусматривающими возможность последующего использования проаналиэированных се- С мян для получения урожая. Применение изобретения в практике селекционных работ позволит обеспечить надежный отбор высокобелковых семян без дополнительной затраты на анализ ценного посевного материала. 5 табл.

1597700

Предложенная совокупность приемов позволяет сократить количество эндосперма, необходимое для проведения анализа, до 20-40 мг, т.е. до количества, отбор которого из проросшего семени не сказывается на жизнеспособности проростка. Такие проростки после определения содержания белка могут быть использованы для получения уро- 10 жая.

Известные способы с применением нингидринового окрашивания не позволяют провести четкую оценку степени

"белковости" семян при использовании количества эндосперма, достаточных для анализа предлагаемым способом.

Результаты оценки содержания белка в. зерновых и зернобобовых предложенным и известным способами приведены в табл. 1.

1I р и м e p 1. В качестве объекта используют семена кукурузы ВИР-44, ВИР-237, сои Кишиневская 16 и Кировоградская 3. Семена высаживают в чашки 25

Петри и проращивают в течение 3-4 дн.

Затем при помощи стеклячной трубки с заостренным концом и нанесенной сна ружи шкалой для определения объема отбирают часть эндосперма и помещают ее в пробирку, добавляют 3 мл 80-70 ного этанола и 1,5 мл 0,3-0,6 -ного раствора нингидрина в ацетоне. Смесь нагревают до кипения, охлаждают и вй-" держивают при комнатной температуре

40 мин.

Интенсивность полученной фиолетовой окраски сопоставляют с интенсивностью окраски эталона либо визуально, либо после измерения на ФЭКе. 4О

Результаты исследования влияния отобранного количества эндосперма на интенсивность окрашивания и жизнеспособность семян после анализа приведены в табл. 2. 45

Пример 2. Оценку содержания белка проводят как в примере 1, за исключением того, что во всех пробах используют 30 мг эндосперма, а коли- . чество этанола для экстракции .варьируют от 1,0 до 4,0 мл.

Результаты, иллюстрирующие зависимость интенсивности окрашивания от используемого для экстракции объема спирта, приведены в табл. 3.

Пример 3, Определение содержания белка проводят как в приме-ре 1, за исключением того, что во всех пробах используют 30 мг эндосперма, а количество добавляемого 0,3-0,6/-ного раствора нингидрина в ацетоне варьируют от 0,5 до 2,5 мл, Результаты, демонстрирующие влияние конечной концентрации нннгидрина в пробе на интенсивность окрашивания, представлены в табл. 4.

Пример 4. Определение содержания белка в эндосперме проросших семян проводят по примеру 1, однако во всех пробах используют объем образца

30 мг, а время выдержки после охлаждения варьируют от 20 до 60 мин.

Зависимость интенсивности окраши-вания от времени приведена в табл. 5.

Из представленных экспериментальных данных следует, что благодаря использованию семенного материала, обо-. гащенного частично гидролизованным белком (семян и зерновых после проращивания),- а также за счет подбора оптимальных усл о вий для пр ов еде ния цв ет— ной реакции (табл. 2-5) достигается более высокая интенсивность окрашивания материала., чем в известных методах с применением нингидриновой реакции. Это, в свою очередь, создает надежную основу для повышения чувствительности анализа и обеспечивает воз можность работы с малыми количествами эндосперма, отбор которых из проросшего семени не отражается на его жизнеспособности (табл. 2).

Применение изобретения в практике селекционных работ позволит обеспечить надежный отбор высокобелковых семян без дополнительной затраты на анализ ценного семенного материала.

Формула и з о б р е т ения

Способ оценки содержания белка в семенах зерновых и зернобобовых культур, включающий экстракцию семенного материала, ббработку экстракта нингидриновым реактивом с последующим кипячением и охлаждением реакционной смеси и сравнение интенсивности окраски раствора с эталонными образцами, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа и обеспечения возможности сохранения жизнеспособности проанализированного материала, экстракции подвергают пробу эндосперма пророщенных семян в ко1597700 рации нингидрина 0,060-0,24Х а после кипячения и охлаждения пробу выдерживают при комнатной температуре 30—

45 мин. личестве 20-40 мг, экстрагируют ее в

2,5-3,5 мл 70-80Х-ного этанола нингидриновый реактив добавляют в виде раствора в ацетоне до конечной концент5

Таблица 1 одержани елка в п оэффиц орреля прото (ч) Содержание белка в про росшем зерн о.с. (предлагаемый способ) ртная ($г) осшем зе е, % (по ъелдалю) 0,97

0,97

0,91

ВИР 44

ВИР 237

К-1

j0i7

9,6

17,5

8,8

7,4

16,4

О, 11

0,092

0,21

Т а блица 2

Условия

0,15 95

0,31 99

0,44 90

0,57 85

0,70 60

0,10

0,26

0,39

0 52

0,65

Количество этано-. ла, мл

3,0

Количество нингидрина, мл

1,5

Время выдержки растворов проб, мин 40

Т а б л и ц а 3

Условия

Количество этанола, мл

0,83

0,46

0,39

0i32

0,25

Количество энде сперма, мг

Количество нингидрина, мл 1,5

Время выдержки растворов мин

Сорт кукурузы Содержа белка в хом зер

Х (по К далю

Количество эндосперма, мг

1,0

2,5

3,0

3 5

4,0

0,040

0,056

0,084

0,114

0,142.0,212

0,098

0,084

0,070

0,050

0,030

0,043

0,064

0,085

О, 106

О, 188

0,076

0,064

0,052

0,040

+ О,Ь75

+ 0,0081

+ 0,14

0 88

0,51

0,44

0,37

0,30

159/700

Таблица 4

Интенсивность окраски растворов атели

Соя КиСоя Кикуруза

P-237 шиневсL кая 16 ровоградская 3

0,024 0,13 О, 14

0,028

0 5 (0,043-0,085) i 0 (0,06-0,12) 0,045 0,26 0,24

0,056

0,064 0,39 0 44

0,084

1,5 (0,1-0,2) 2;О (0,12-0,24) 0,085 0,52 0,59

0,112

0,206 0,85 0,84

0,240

2,5 (0,136-0,?7) Количество эндосперма, мг

Количество этанола, мл

3,0

Время выдержки растворов, мин

Таблица 5

Время выдержки растворов, мин

Количество эндосперма, мг

Количество этанола, мл

3,0

Количество нингидрина, мл

1,5

I Составитель О. Скуратовская

Редактор А. Шандор Техред Л.Олийнык . Корректор T. Малец

Заказ 3048 Тираж 511 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям лри ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðîä, ул. Гагарина,101

Количество нингидрина в ацетоне, мл и его конечная концентраЖ

0,050

0,080

0,084 .

0,070

0,050

0,045

0,060

0,064

0,059

0,040

0,20

0,37

0,38

0,32

0,28

0,25

0,42

0,44

0,40

0,30