Способ получения иммобилизованного @ н-градиента для изоэлектрического фокусирования белков
Изобретение относится к получению иммобилизиванного PH-градиента для изоэлектрического фокусирования белков в полиакриламидном геле. Цель изобретения - расширение диапазона PH - градиента и упрощение процесса. Получение ведут путем введения в полимеризуемую смесь содержащую акриловый мономер, инициатор полимерзиации и акриламид [N-этиленсульфоновую кислоту], акриламидотетраэтилентетрамин. Процесс идет в две стадии против восьми. 3 ил.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
PECflY6JlHH (5g)5 С 01 Х 27/26
ОПИСАНИК ИЗ0БРКткниЯ
К А ВТОРСКОМ У СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Н,С-СН - (NH-CH -СН -),NH
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗО6РЕТЕКИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР. (21) 4455589/31-04 (22) 05. 07. 88 (46) 23.09.90. Бюл. Р 35 (71) Институт химии АН ЭССР и Институт экспериментальной биологии
АН ЭССР (72) С.О.Пихлак и А.П.Полокайнен (53) 547,964.407 (088.8) (56)Gianazza E. и др, Preparation of
immobilized pH-gradients spanning
2-6 рН units with.two-chamber mixers:
evaluation of two experimental approaches.. Electrophoresis, 1984, 5, 88-97. Изобретение относится к способу получения иммобилизованного рН-градиента для изоэлектрического фокусирования белков, который может найти применение в биохимии.
Цель изобретения — повышение надежности получения линейного иммобилизованного рН-градиента широкого диапазона, упрощение и удешевление технологии его получения.
На фиг.1 изображена кривая титрования акриламидопентаэтиленпентамина (1) и акриламидотетраэтилентетрамина (2); на фиг.2 — кривая титрования рН 7.0 иммобилина. Пример. Формирование иммоби лиэованного рН-градиента в полиакриламидном геле, где в качестве буферирующего компонента использован акриламидотетраэтилентетрамин (АТЭТА):
„„80„„1594409 А 1
2 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО рН-ГРАДИЕНТА ДЛЯ ИЭОЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ФОКУСИРОВАНИЯ БЕЛКОВ (57) Изобретение относится к получению иммобилизованного рН-градиента для изоэлектрического фокусирования белков в полиакриламидном геле. Цель— расширение диапазона рН-градиента и упрощение процесса. Получение ведут путем введения в полимеризуемую смесь, содержащую акриловый мономер, инициатор полимеризации и акриламид (N)-этиленсульфоновую кислоту, акриламидотетраэтилентетрамин. Процесс идет в две стадии против восьми по известному способу. 2 ил.
C е буферирующий в широком диапазоне рН (от 3 до 10).
Для создания иммобилизованного рН-градиента используют двухкамерный градиентный смеситель, в одну иэ камер которого вносят раствор конца основного состава, а в другую — раствор конца кислого состава формируемого градиента, Основной, легкий раствор: 530 мкл смеси акриламида (28,8 вес.%/объем) с бисакриламидом (1,2 вес.i!/объем), 40 мкэкв. АТЭТА, т.е. 2,43 мг, мол.вес 243 и 4 мкэкв. акриламидоэтиленсульфоновой кислоты (АЭСК), т.е. 716 мкт, мол.вес. 179.
1594409
Добавляют до 3500 мкл воду и"
25 мкл 10%-ного, N N, N,,Ы -тетра- " метилэтицендиамина (ТЕИЕД), доводят рН до 7,0, добавляют 20 мкл 10%-ного рствора персульфата аммония и доводят объем раствора до 4000 мкл.
Кислый, тяжелый раствор: 1000 мкл
20Х-ного глицерина, 530 мкл смеси: акриламида (28,8 вес.%/объем) с биса- 10 криламидом (1,2 вес.X/àáúåè), 40 мкэкв, АТЕТА т.е. 2,43 мг, и
36 мкэкв. АЭСК т.е. 6,44 мг.
Добавляют до 3500 мкл воду и
25 мкл 10Х-ного ТИПД, доводят рН до
7,0, добавляют 20 мкл 10Х-ного раствора персульфата аммония и доводят объем раствора до 4000 мкл.
Градиент перемешивают в течение
3-8 мин при комнатной температуре, оставляют для уравновешивания при той же температуре на 15 мин и затем осуществляют полимеризацию в, термо-.. стате в темноте при 50 С в течение
60 мин. Полученный гель толщиной 25
0,5 мм отмывают от незаполимеризовавшихся компонентов сначала в течение 1 ч в 1 л воды, за" åì еще в течение 1 ч в 1 л 1Ж-ного глицерина и, наконец, сушат при комнатной темпера- 30 туре. Выход геля, установленный экспериментально, составляет практически 100Х. Необеэвоженный гель может храниться при 4 С в герметичной упаковке (например, в полиэтиленовом пакете) в течение нескольких недель (не менее 2-3). Высушенный же гель в тех же условиях может храниться в течение нескольких месяцев (не менее 5-6). рЮ
Перед использованием сухому гелю дают набухнуть в течение 2 ч в ячейке, содержащей только воду нли при необходимости, воду, включающую антиконвеКционные компоненты — сахарозу, глицерин и т.п., а также амфолиты (до 0,5%).
При осуществлении предлагаемого способа достигается упрощение технологии получения рН за счет сокращения числа исходных компонентов (2 вместо 8, кроме входящих в полимериэационную смесь геля), удешевляется процесс эа счет применения недорогих и доступных исходных комI понентов (буферирующего и титранта), повышается надежность получения линейного иммобилизованного рН-гра1 диента: изменяется лишь угол наклона, но не характер (форма) кривой титрования.
Формула и з о б р е т е н и я
Способ получения иммобилизованного рН-градиента для изоэлектрического фокусирования. белков в полиакриламидном геле путем введения в полимеризуемую смесь, содержащую акриловый мономер, инициатор полимеризации и титру-ащий компонент, буферирующего. компонента и последующей полимериэации, отличающийся тем, что, с целью расширения диапазона рН-градиента и упрощения процесса, в качестве буферирующего компонента используют акриламидотетраэтилентетрамин, а в качестве титрующего компонента — акриламид (И)-этиленсульфоновую кислоту.
