Ингибитор протеолиза

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в биохимии, экспериментальной кардиологии, терапии. Целью изобретения является выявление средства, ингибирующего протеолиз, пептидной природы, получаемого синтетическим путем. Для ингибирования протеолиза в экспериментальных исследованиях используют брадикинин. Изобретение позволяет выявить препарат пептидной природы, конкретно ингибирующий активность калликреина, обладающий способностью подавлять протеолитические процессы при экспериментальном инфаркте миокарда. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 А 61 К 37/64

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (? 1) 4418602/30-14 (22) 03. 05.88. (46) 30.07.90. Бюл. ¹ ?8 (71) Хомский медицинский институт (72) Г.А. Суханова (53) 612. 015 (088. 8) (56) Вопросы медицинской химии, 1980, № 6, с. 832-836. (54) ИНГИБИТОР ПРОТЕОЛИЗА (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано в био-. химии, экспериментальной кардиологии, Изобретение относится к медицине, а конкретно к медицинской биохимии, может быть использовано в биохимии, экспериментальной кардиологии, терапии, и касается средств, ингибирующих протеолитические ферменты.

Цель изобретения — выявление средства, ингибирующего протеолиз, пептидной природы, получаемого синтетическим путем.

Пример 1. В работе используют следующие препараты: трипсин (Спофа, ЧССР), химотрипсин и андекалин (отечественные препараты), калликреин плазмы крови человека, выделенный и очищенный по известному методу; брадикинин-триацетат (Реанал, BHP), контрикал (VEB, ГДР). Для определения активности протеиназ используют в качестве субстрата N-бензоил- .-аргинин этиловый эфир (БАЭЭ, Реанал, BHP).

Молекулярный вес каждого фермента определяют гель-хроматографией на сефадексе-G-100.

„„SU,, 1581321 А 1

2 терапии. Цель изобретения — выявление средства, ингибирующего протеолиз, пептHpíîé природы, получаемого синтетическим путем. Для ингибирования протеолиза в экспериментальных исследованиях используют брадикинин.

Изобретение позволяет выявить препарат пептидной природы, конкурентно ингибирующий активность калликреина, обладающий способностью подавлять протеолитические процессы при экспериментальном инфаркте миокарда.

3 табл.

Внаимоденотвие брадикинина и конт- (/) рикала с протеиназами изучают с по31 8I мощью кинетического анализа. Ферменты инкубируют с ингибитором в течение 1.5 мин, используя следующие концентрации: растворов ферментов (10

10 M) брадикинина (10 -10 М), контрикала (10 -10 3М), БАЭЭ (2х10

1х10 М). Затем измеряют БАЭЭ вЂ” эстеразную активность фермента в присут—

Ф ствии и отсутствии ингибитора, строят графики в координатах Михаэлиса и

Лайнуивера-Бэрка, определяют К Ю и V „ . Для определения эффективной рд<КС дозы брадикинина и контрикала для трипсина и химотрипсина определяют

I g, т . е . концентрацию ингибитора, снижающую скорость БАЭЭ вЂ” эстеразной реакции на 507. На основании этих данных рассчитана I -доза: для бра5о дикинина — I мкМ и контрикала

100 мкМ. Таким обра.зом, эффективная концентрация брадикинина в качестве ингибитора трипсина и химотрипсина

1581321

50 в 100 раз меньше, чем контрикала.

Брадикинин конкурентно ингибировал БАЭЭ-эстеразную активность андекалина, калликрейна плазмы крови че" ловека с К 5 2х10 И; 2 4х10 М соответственно, и являлся неконкурентным ингибитором для трипсина и химотрипсина, снижая Ч„»„, на 50%.

Контрикал, взаимодействуя с трипси ном, химотрипсином, андекалином и калликреином плазмы, обладал- свойствами неконкурентного ингибитора.

Такг.м образом, орадикинин можно использовать как специфический конкурентный ингибитор калликреина плазмы и тканей в биохимических исследованиях при изучении взаимодействия активного центра протеиназ с эффекторами. 20

Пример 2 .. Для выявления характера действия брадикинина в организме изучают активность.калликреина плазмы крови мышей и его предшественника при внутривенном введении пре- 5 иарата.

Брадикинин триацетат, приготовленный на физиологическом растворе, вводят в хвостовую вену мьппам линии

BAIB/ñ. Доза препарата 1 мг/кг массы 3О пересчитана по эффективной дозе, най» денной в предыдущей серии. Контрольным животным вводили Физиологический раствор . Через 2, 6 ч, 1,3, 7 сут . после введения брадикинина определяют ак35 тивность калликреина и калликреиногена плазмы крови ьышей. Результаты этого исследования представлены в табл. 1.

Снижение активности калликреиноге0 на и калликреина плазмы крови мышей наблюдалось в течение 6 ч после введения брадикинина. Наиболее значительное торможение активности калликреина (на 47%) происходило через 4 ч, 45 активность калликреиногена, предшественника фермента, подавлена на 5667% через 1-6 ч„после ийъекции препарата мышам.

Таким образом, введение брадикинина мышам линии BAIB/с также как в условиях in vitro вызывает подавление активности калликреина и калликреиногена плазмы крови. Более значительный эффект характерен для пред35 шественника фермента.

Пример 3. В опытах используют беспородных белых крыс самцов массой . 150-180 г. Брадикинин-триацетат (ВНР) вводят в хвостовую вену в дозе

1 мг/кг массы, контрольным животным вводили физиологический раствор. Через 2,6 ч, 1,3,7 сут. после введения брадикинина определяют активность катепсина D печени и сердца. Свободную и общую активность фермента определяют в отсутствии и присутствии

О, 1%-ного раствора тритора Х-100 соответственно по расщеплению гемоглобина и выражают в нмоль тирозина/мг белка в 1.мин по методу Аксона.

В условиях in vitro добавляют

1 мкМ брадикинина в среду инкубации гомогенатов печени и сердца в процессе определения активности катепсина D. Данные этих опытов представлены в табл. 2.

При инкубации с брадикинином более значительно снижалась активность катепсина D сердца, чем печени: свободная — на 40 и 29%, общая — на 32 и 25% соответственно.

В результате изучения активности катепсина D печени и сердца в условиях in vivo была .показано, что при внутривенном введении брадикинина крысам происходило уменьшение активности фермента сердца и печени на 2040% по сравнению с контролем в течение 24.ч, а затем наблюдалось восстановление. Следует отметить, что более существенное подавление активности катепсина D брадикинином характерно для сердечной мышцы.

Пример 4. Инфаркт миокарда моделируют путем перевязки левой коронарной артерии. Брадикинин и контрикал вводят через 1 ч после операции внутривенно в дозах 1 мг/кг.и

7500 ед/кг массы соответственно. Через 1 сут, после операции крыс декапитируют, извлекают сердце и печень, готовят гомагенаты в отношении 1:10 на охлажденном 0,25 М растворе сахарозы (рН 7,4). В гомогенатах определяют общую и свободную активность катепсина D.

Результат опытов по изучению активности катепсина D в органах при введении брадикинина и контрикала на фоне инфаркта миокарда представлены в табл. 3. При инфаркте миокарда у крыс происходят значительные изменения активности катепсина D в ткани сердца., Через 1 сут. после пере" вязки коронарной артерии наблюдалось увеличение свободной активности

15813!

Калликреин Калликреиноген

Срок после введения

ME/мл плазмы

Контроль (9) *

1 ч (10)

4 ч (8)

6 ч (10)

1 сут.(8)

3 сут.(8)

7 сут.(9) 309, 1+18 э 2

260, 7й33, 2

163,6+27, 3* ь

236, 3 ф12 э 1**

358, 1ф? 1,5

283,6+31,3

301,8 36,5

1754,4+45,0

678 э бф 21,5*»

5 70 э 8+43, 69 *

763, 5 120, 1**

14 03, 5 48, 4 *9I

1729 э 11132 э 9

1652, 6+88, 4

* В скобках указано число опытов.

** — Достоверные изменения.

Таблица 2

Контроль

Брадикинин

Свободная Общая

Свободная Общая!

Печень

7, 19 О, 61

Р (Оэ05

4э82+Оэ32

Р (0,05

2,97+0,39

4,44+Оэ45

9в 62+0p 88

7э06+Оэ56

2, 11+0, 28 P .р 0,05

2э 6410э 30

P (0,05

Сердце

П р и м е ч а н и е. Представлены данные 6 опытов.

Таблицв3

Инфаркт P миокарда е контрикал

Ифаркт P миокарда + брадикнннн

Интактные Инфаркт P миокарда

Своболная 4,44+0,35

7,56+0,36 <О AAI

Серлце

7,0660,36 In, 02 О, 23 со, 001

Общая

2,77+0,60 эО>5 3,6250>29 >0,5

Свободная 2,9!50,49 3,3880,86 . >0>5 печень

Общая

8, 08>. О, 58 70, 05

9,62 0,56 9,78>0,60 70,5

8,2521,65 э0>I

°

0 р и и е ч а н и е. В каялод группе испольэовало по IA крыс. катепсина D в 1,7 раза, а общей — в

1,4 раза. В печени, не. подвергавшей-. ся повреждению, отмечено несущественное возрастание свободной активности фермента. Брадикинин и контрикал, введенные через 1 ч после скклюзии венечной артерии, подавляют свободную активность катепсина D сердца на

49 и 417, а общую активность на 30 и 37Х соответственно. В печени при введении брадикинина наблюдалось снижение активности катепсина D: свободной — на 197., общей — на 16Х. При введении контрикала происходит несущественное увеличение свободной и снижение общей активности фермента— на 17Х.

Следовательно, брадикинин, также как контрикал, обладает отчетливым

21 6 ингибирующим действием на протеолитическую активность катепсина D при инфаркте миокарда у крыс, особенно в поврежденной ткани сердца.

Изобретение позволяет выявить препарат пептидной природы, конкурентно ингибирующий активность калликреина, обладающий свойствами ингибитора протеолиза при зкснериментальном инфаркте миокарда. Эффективная концентрация брадикинина в 100 раз меньше, чем контрикала, используемого в терапии, кардиологии для ингибирования протеолиза.

Формула изобретения

Применение брадикинина в качестве ингибитора протеолнза для экспериментальных исследований.

Т а блица 1

3,84+0,69 4A,ÎAI 4,48+1,35 <О> AS

7,00+1,00 40,0! 6, 282 I, 24 <п, 001