Способ получения ингибитора глюкозидаз

ОП И Е («) 454750

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союэ Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (61) Зависимый от патента (51) М. Кл. С 12d 13/00 (22) Заявлено 23.12.71 (21) 1728264/31-16 (32) Приоритет 28. 12. 70 (31) P 2064092.0 (33) ФРГ

Опубликовано 25.12.74. Бюллетень № 47

ГЭС@еpCTB8NHbl3l хомИТВ1

Совета Мммистров СССР оо долам мэобретоной и ОткрытиЙ (53) УДК 615.779.94 (088.8) Дата опубликования описания 06.02.75 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Вернер Фроммер, Вальтер Пульс, Дитмар Шефер и Дельф Шмидт (ФРГ) Иностранная фирма

«Байер АГ» (ФРГ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ГЛЮКОЗИДАЗ

Изобретение относится к производству лекарственных препаратов.

Известен способ получения ингибиторов амилазы, заключающийся в том, что пшеничную муку грубого помола экстрагируют 10—

90%-ными водными растворами низших спиртов или водными электролитами прп рН 1,0—

7,0 и выделяют цслсвой продукт изустными приемами.

Целью изобретения является повышение удельной активности и выхода целевого продукта.

Для этого в качестве исходного сырья используют мицелий и/или культуральную жидкость актиномицетов.

Из проб земли известным образом выделяют штаммы порядка Actinomycetales особенно семейств Streptomycetaceae u Асi«пор1апасеае или приобретают штаммы этого порядка из коллекций штаммов. Посевным материалом из этих штаммов засевают колбы для выращивания культур с жидкими питательными средами. Можно использовать, например, жидкую глицерина-гликокольную питательную среду, по фон Плота, состоящую из 2% глицерина, 025% гликоколла, 0 1% NaCl, 0,1 ю/ю

К НРО„, 0,01ю/ю Ге504 7 НО, 0,01% MgSO4

7 Н О и 0,01% СаСОэ. Для ускерения роста целесообразно к подобной среде добавлять комплексныс источники углерода, например, воду от набухшей кукурузы или соевую муку, или дрожжевой экстракт, или белковые гид5 ролизаты, например NZ — амины, илп смеси этих веществ. В таких случаях необходима регулировать значение рН жидкой питательной среды (начальное значение рН 6 0 — 8,0, предпочтительно) 6,5 — 7,5.

10 Глицерин жидкой питательной среды можеI быть заменен другими источниками углерода, такими как глюкоза пли сахароза, или крахмал, или смеси из этих веществ. Вместо гликоколла можно использовать и другие ис15 точники азота, например, дрожжевой экстракт, соевую муку NZ-амины, «Phat.mamedia» и другие, Концентрации источников углерода и азота, 20 а также концентрации солей колеблются в широких пределах, причем FeSO4, СаСО3 и

Мд504 могут полностью отсутствовать, Подают, например, 100 — 200 мл жидкой питательной среды в колбы Эрленмейера емко25 стью 1 л, стерилизуют известным способом, засевают исследуемым штаммом и инкубируют колбы на аппарате для встряхивания при

15 — 60 С, предпочтительно прп 24 — 50 С.

454750

15

Мицелии экстрагируют два раза ацетоном, каждый раз пятикратно (по отношению к объему мицелия), а потом один раз пятикратным объемом диэтилового эфира. Извлеченный мицелиевый остаток высушивают в вакууме при

20 С, полученный сухой порошок из мицелия извлекают 4 — 8 вес. ч. диметилсульфоксида (ДМСО) .

Ингибиторы глюкозидаз являются пригодными терапевтическими средствами при следующих показаниях: ожирение, гиперлипсмия (атсросклероз), диабет, предиабет, гастрит, Ulcus ventriculi, Ulcus duodeni и кариес. Токсичность ингибиторов глкгкозидаз чрсзвы гайно мала.

Пример 1. Каждую из трсх колб Эрленмейера емкостью 1 л, которые содержат

200 мл жидкой питательной среды, состоящей из 2 /О крахмала, 1 /о глюкозы, 0,5О/о IXZ-аминов, 1 /о дрожжевого экстракта, 04 /о СаС03 (стерилизация 30 мин при 121 С, перед стерилизацией рН 7,2) засевают 1 мл предварительной культуры штамма CBS 951.70. Abpullariellae regularis, полученной в той же жидкой питательной среде инокулированной культурами, выращенными в пробирках со скошенным агаром на основе овсяных хлопьев, и инкубируют при 28 С на вращающемся аппарате для встряхивания. После культивирования в течение

5,5 дней соединяют содержимое трех колб и отделяют мицелий центрифугированием. Получают 425 мл жидкости, содержащей 100

ЕИА/мл.

Отделенную жидкость сгущают в ротационном испарителе при 15 — 20 торр и температуре водяной бани — 37 до 60 мл. Вязкий раствор смешивают с 480 мл этанола. Выпадающий осадок собирают центрифугированием, растворяют опять в 60 мл воды и подвергают диализу в течение 6 час с дистиллированной водой, диализат затем лиофилпзуют.

Выход: 1,6 r с 19 10З ЕИА/г.

П р имер 2. Из среды, описанной в примере 1, при центрифугировании получают

440 мл отделенной жидкости с 100 ЕИА/мл.

Эту жидкость сгущают в ротационном испарителе до 100 мл. Сгущенньш раствор вмешивают в 800 мл этанола, осадок собирают центрифугированием и после двукратной промывки ацетоном и однократной промывки простым эфиром сушат при комнатной температуре в вакууме.

Выход; 2,2 г с 15 10 ЕИА/г.

Пример 3. Каждую из трех колб Эрлснмейера емкостью 1 л, содержащие по 200 мл жидкой питательной среды, состоящей из 3% глицерина, 3 /о осевой муки, 0,2 /о СаСО> (стерилизация 30 мин при 121 С, после стерилизации рН 7,2) засевают 1 мл предварительной культуры штамма CBS Actinoplanes spec (полученной в той же жидкой питательной среде, инокулированной культурами, выращенными в пробирках со скошенным пептонно—

65 казенновым агаром г1а ска) и подвергают трехдневной инкубации при 28 С на вращающемся аппарате для стряхивания.

После инкубации соединяют содержимое колб и отделяют мнцелпй центрифугированием. Получают 500 мл отделенной жидкости, содержащей 450 ЕИА/мл.

Отделенную жидкость смешивают при размсшивапии отдельными порциями с 250 г

ХН-сульфата, а затем цептрифугируют в течение 10 мин со скоростью 12 000 об/мин.

Осадок растворяют в 100 мл дистиллированной воды и смешивают с 400 мл ацетона.

11олучается легко выпадающий осадок, его декантируют, два раза промывают ацетоном и один раз простым эфиром и сушат в вакуу»е.

Выход: 13,4 г 10 10 ЕИА/г.

Пример 4. При засеве 120 мл жидкой питательной среды, описанной в примере 1, находящейся в колбе Эрленмейсра, емкостью в

1 л культурой штамма АТСС 3319 Streptomyces flavcolus, выращенной в пробирке со скошенным агаром, после культивирования в течение 3 дней при 28 С на вращающемся аппарате для встряхивания получают культуральный раствор, который содержит 25 ЕИА/мл.

Пример 5. Если засевают 24 колбы, содержащие по 120 мл жидкой питательной среды, описанной в примере 3, предварительной культурой штамма CBS 955.70 Actinoplanes

spec. и подвергают их в течение 5 дней инкубации при 28 С, то в результате центрифугирования получают 2,0 л отделенной жидкости 1,1 ЕИА/мл. Эту жидкость сгущают в ротационном испарителе Io 200 мл и в течение суток подвергают диализу при комнатной температуре с 2 л дистиллированной воды в диализационном шланге Вискинга. Наружную среду, содержащую ингибитор, сгущают вращением до 100 мл и вкапывают при размешивании в 900 мл абсолютного этанола. Выпадающий почти неактивный осадок отделяют центрифугированисм и удаляют, а отделенную центрифугированием спиртовую жидкость сгу цают при вращении до 30 мл (1 мл этого концентрата содержит 70 ЕИА/мл.

Для дальнейшей очистки этот раствор пропускают через- анионообменную смолу (амберлит типа 1RA 410, ацетатная форма в

0,05 М ацетате аммония, рН 7; размер слоя 2,5.

20 см), соединяют активные фракции и подвергают гельфильтрации с помощью «Sephaйсх" Ci 75» в воде. Активные фракции от гельфилы рации сгущают до 12 мл.

1 мл этого раствора содержит 150 ЕИА/мл.

500 мл мицслия извлекают два раза с помощью 1 л ацетона и один раз с помощью

1 л простого эфира, экстракты соединяют и сгущают при вращении в вакууме досуха.

Получаемый мицелиевый остаток сушат в вакууме при 20 С, а полу. чаемый сухой порошок мицелия (-51 г) извлекают в течение 2 час

454750

Предмет изобретения

Составитель С. Щенева

Техред Т. Миронова

Редактор Д. Пинчук

Корректор Н. Стельмах

Заказ 154/18 Изд. № 215 Тираж 456 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, )К-35, Раушская наб., 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

5 при комнатной температуре с помощью 150 мл диметилсульфоксида. После центрифугирования в течение 30 мин при 15 000 об/мин) досуха сгущенный ацетоново-эфирный экстракт поглощается находящейся над порошком жидкостью диметилсульфоксида.

Выход ингибитора: 120 мл с 3 ЕИА/мл.

Способ получения ингибитора глюкозидаз, отличающийся тем, что, с целью повышения удельной активности и выхода целевого продукта, в качестве исходного сырья используют мицелий и/или культуральную жидкость актиномицетов.