Способ дифференциации штаммов вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом

 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в лабораторных исследованиях при изучении вируса-возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Целью изобретения является упрощение и повышение точности способа. Цель достигается тем, что клетки инфицируют штаммами вируса ГЛПС, после инфицирования получают щитоплазматический лизат, из которого путем инкубации с иммунными антителами, фиксированными на сорбенте, изолируют специфические рибонуклеопротеидные комплексы (РНП), характеризующие принадлежность исследуемого материала к роду Хантавирус. Экстракцию ДНК проводят из изолированных РНП электрофорезом в полиакриламидном геле, определяют индивидуальную электрофоретическую подвижность геномных РНК, по которой выявляют сходство или различие между штаммами ГЛПС. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИЫ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМ Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И О1НРЫТИЯМ

1 1РИ ГКНТ СССР (21) 4427965/30-13 (22) 17. 05. 88 (46) 30.04 ° 90. Бюл. 1(р 16 (7 1) Белорусский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (72) И.С.Лукашевич, Т.А.Стельмах, Е,П.Счесленок, Н ° В.Каверин, Н.Л.Варич, Е.А.Ткаченко и А.Я.Пашков (53) 616. 98: 578. 833 (088. 8) (56) Ткаченко E.A. и др. Применение твердофазных иммуносорбенных методов (энзимного и радиоиммунологического анализа) для лабораторной диагностики аренавирусных инфекций, крымской геморрагической лихорадки и геморрагической лихорадки с почечным;синдромом. Метод рекомендации. И., 1982, с. 3-21.

Rodger S.М,, Holmes I.H. — I, of

virol, 1979, v. 30, р. 839 846. (54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТА2210В

ВИРУСА ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С

ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в лабораторных исследованиях при изучении вируса — возбудителя гемморрагической лихорадки с почечным синдромом.(ГЛПС).

Целью изобретения является упрощение и повышение точности способа.

Пример. Клетки Чего Е-6 выращивают на 1 л матрасах, инфицируют штаммами вируса ГЛПС (например, УФА

CG-1820, выделенного в лаборатории на культуре клеток Vего Е-6 из легоч„80„„3 560550 А I (1) i С 12 N 7/00 А 61 В 10/00

2 (57) Изобретение относится к меди-. цинской вирусологии и может быть использовано в лабораторных исследованиях при изучении вируса — возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Целью изобретения является упрощение и повышение точности способа. Цель достигается тем, что клетки инфицируют штаммами вируса ГЛПС, после инфицирования получают цитоплазмаъический лизат, из которого путем инкубации с иммунными антителами, фиксированнь ми на сорбенте изолируют специфические рибонуклеопротеидные комплексы (РНП), характеризующие принадлежность исследуемого материала к роду Хантавирус.

Экстракцию ДНК проводят из изолированных РНП электрофорезом в полиакриламидном геле, определяют индивидуальную электрофоретическую подвижность геномных РНК, по которой выявляют сходство ипи различие между Эаи4 штаммами ГЛПС, l табл.

Щ ной ткани рыжей полевки Cl glareolus отловленной в очаге ГЛПС, н 4590, выделенного на культуре клеток Vего

Е-6 из легочной ткани Ар, peninsulae).

Инкубируют в среде Игла — 2ИЕИ с 27" ной эмбриональной сывороткой в течение 8 сут. На 5-е сутки инфицирования в среду поддержки вносят Н -уридин по 100 мкКи/мп. После окончания инкубации среду поддержки удаляют, инфицированные клетки используют для получения клеточных лизатов. Затем клеточный монослой промывают холодной

1560550 средой Игла, остатки среды отсасывают и клетки лизируют 0,7 тритона

Х-100 в 0,6 М КС1, 0 051 — трис НС1, рН 7,5, с 200 мкг/мл гепарина при

4 С в течение 20 мин. Лизат центрифугируют при 4ОС 10 мин при

1200 об/мнн, надосадок собирают и используют в реакции иммуносорбции.

В качестве сорбента используют взвесь протеин А-сефарозы СЬ-4В, которую перед употреблением трижды отмывают суспендированием в 10-кратных объемах сорбирующего буфера (СВ, 0,15N, NaC1, 0,001 М ЭДТА, 0,05 М 15 трис НС1, рН 8,0) с последующим осаждением на центрифуге при 2000 об/мин в течение 10 мин. После отмывки осадок, суспендированный в солевом буфере (СВ в виде 10 -ной суспензии), смешивают с равным объемом (по 200мкл) сыворотки крови переболевших ГЛПС людей из Европейской части СССР и с

Дальнего Востока и встряхивают в те чение 1 ч на холоду, затем инкубируют 25 при 4 С 16 ч. По окончании инкубации образовавшиеся иммуносорбеитные комплексы (протеин . А-сефароза — антите.ло) отмывают дважды СБ с 0,25 альбумина, один раз с альбумином и гепари- 30 ном (200 мкг/мл) и используют в реакции иммуносорбции в виде 10 -ной сус;пензии в СБ с альбумином и гепарином.

K 200 мкл 10 -ной иммуносорбентной суспензии добавляют по 1 мл осветленного лнзата, смесь инкубнруют 1 ч на холоду, периодически встряхивая. Образовавшиеся комплексы протеин А-сефароза. — антитело - антиген осаждают при 5000 об/мин 5 мин. Осадки отмы- 4 вают дважды СБ, содержащим 200 мкг/мл гепарина и 0,05 тритона Х-100. Во второй отмывке концентрацию NaC1 доводят до 0,5 И. После отмывки осадки суспендируют в 0,8 мл НТ3 (0,1 М НаС1 45

0,01 М трис НС1, рН 7,4, 0,001 М

ЭДТА) и отбирают аликвоты для определения кислотонерастворимой радиоактивности.

Для контроля на специфичность ре-. акции иммуносорбции рибонуклеопротеидов (РНП) иэ лизатов клеток, инфицированных анализируемыми штаммами вируса ГЛПС, аналогичные операции про-. водят с лизатами иэ неинфицированных

55 клеток.

Результаты определения специфичности реакции иммуносорбции приведены в таблице.

Клеточные лизаты

503 300

12 220

96 300

18 850

Из таблицы видно, что количество меченого материала, содержащегося в составе РНП в опытных пробах, значительно превьппает его содержание в контрольных пробах. Это свидетельствует об образовании в опытных пробах иммунных комплексов (РНП-антитело).

Взаимодействие антител сывороток реконвалесцентов с нуклеокапсидными белками рибонуклеопротеидных комплексов, изолированных из клеток, инфицированных анализируемыми штаммами вируса ГЛПС, подтверждает принадлежность этих штаммов к роду Hantavirus и свидетельствует о специфичности реакции иммуносорбции.

Для проведения дифференциации штаммов по индивидуальной электрофоретической подвижности геномных РРП< из изолированных РНП экстрагируют

РНК. Для этого к иммуносорбентным комплексам, суспендированным в НТЭ, добавляют додецилсульфат натрия до конечной концентрации 1, проказу с конечной концентрацией 200 мкг/мл и равный объем фенола, насыщенного НТЭ.

Депротеинизацию PHK проводят дважды и PHK преципитируют 2,5 объемами перегнанного этанола. Экстрагированные

РНК анализируют электрофореэом.в

2,4 -ном полиакриламидном геле, содержа1цем ? М мочевины, 18 ч при 100 Ч с последующей обработкой для радиоавтографии.

В результате проведенных исследований определено, что геном анализиИз клеток, инфицированных штаммом CG"1820

Из неинфицированных клеток (контроль)

Из клеток, инфи-. цированных штаммом 4590

Из неинфицированных клеток (контроль) 1<оличество меченого материала в составе РНП, изолированных иммуносорбцией, cpm

Формула изобретения

Составитель С.Светлышев

Редактор Л.Веселовская Техред Л.Олийнык Корректор M. Шароши

Заказ 951 Тираж 49) Подпи сно е

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР .

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 10!

5 156055 руемых штаммов вируса ГЛПС представлен тремя сегментами PHI(— L, М, S.

Анализ электрофоретической подвижности геномных РНК штаммов 4590 (дорожка 3) и CG-1820 (дорожка 4) выявил различие между штаммами. $-сегмент штамма 4590 имел большую электрофоре. тическую подвижность в геле по сравнению с S-сегментом штамма CG-1820.

Таким образом, применяя предлагаемый способ, удалось дифференцировать штаммы вируса ГЛПС, циркулирующие на

Дальнем Востоке и в Европейской части

СССР, по относитепьнЬи подвижности их геномвых сегментов, выделенных из внутрицитоплазматических РНП. Способ отличается простотой и эффективностью.

Простота достигается тем, что в отличие от способа-прототипа исключаются 20 такие этапы, как очистка и концентрация вируса, связанные с ультрацентрифугированием. Введенные этапы являются менее трудоемкими и не требуют специальной квалификации персонала. 25 . Эффективность способа заключается в том, что на первом этапе исследования он позволяет сделать заключение о

0 6 принадлежности исследуемого материала к роду Хантавирус.

Метод может найти. применение также при изучении вирусов, характеризующихся низкой репродуктивной способностью (например, аренавирусов).

Способ дифференциации штаммов ви-. руса геморрагической лихорадки с почечным синдромом, включающий идентификацию родовой принадлежности вирусов-,изолятов с последующим определением штаммовой принадлежности путем анализа электрофоретической подвижности вирусных геномных РНК, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью, упрощения способа и повышения его точности, идентификацию родовой при" надлежности нзолятов.вируса осуществляют путем анализа радиоактивности комплекса протеин А-сефароэа — антитело с рибонуклеотидами из лизатов культур .клеток, выращенных в присутствии Н -уридина и инфицированных вирусами-иэолятами.