Штамм бактерий rнizовiuм тrifоlii, используемый для получения нитрагина под луговой клевер

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой новый эффективный штамм клубеньковых бактерий, используемый для изготовления нитрагина под луговой клевер. Целью изобретения является создание нового штамма клубеньковых бактерий, обладающего повышенной эффективностью в симбиозе с луговым клевером. Штамм RHIZOBIUM TRIFOLII выделен из клубеньков лугового клевера и депонирован в коллекции ВНИИСХМ N1360. Штамм позволяет увеличить урожай лугового клевера на 2,6 ц/га абсолютно сухой массы клевера по сравнению с известным штаммом. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPGHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4437912/30-13

1 (22) 07.06,88 (46) 07.04.90, Бюл. !11 13 (71) Вежайчский филиал Литовского научно-исследовательского института земледелия (72) Э,-А.Б.Лапинскас (53) 631.847.211 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Р 1039934, кл . С 05 F 1 1/08, 1983 . (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ RHIZOHIUM TRIFOLII, ИСПОЛЬЗУЕЖ!Й ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ НИТРАГИНА ПОД ЛУГОВОЙ КЛЕВЕР (57) Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и предИзобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой новый эффективный штамм клубеньковых бактерий, используемый для изготовления нитрагина под луговой клевер.

Цель изобретения — создание нового штамма клубеньковых бактерий, I обладающего повышенной эффективностью в симбиозе с луговым клевером.

Штамм Rhizobium trifolii P 99 депонирован в коллекции Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии под N - 1360 и характеризуется следующими признаками..

Иорфолого-культуральные признаки:. в молодом возрасте бактерии палочковидные, размер клеток на гороховом агаре после 48 ч инкубации 0,8 х х 2,2 мк. Хорошо окрашивается в крас.80 З55Еир А (51)5 С. 05 F 11/08, С 12 N 1/20

2 ставляет собой новый эффективный штамм клубеньковых бактерий, используемый для изготовления нитрагина пол луговой клевер. Целью изобретения является создание нового штамма клубеньковых бактерий, обладающего повышенной эффективностью в симбиозе с луговым клевером. Штамм НЬ яоЬ1пш

trifolii выделен из клубеньков лугового клевера и депонирован в коллекции ВНИИСХ!! !! - 1360. Штамм позволяет увеличить урожай лугового клевера на 2,6 ц/га абсолютно сухой массы клевера по сравнению с известным штаммом. 2 табл. ный цвет раствором ЗОБ-ного эритрозина и 5Х-ного фенола.

Физиолого-биохимические свойства: органические среды. На гороховой среде (рН 7,0-7,2) колонии гладкие (форма S), круглые с ровными краями.

Диаметр колоний семисуточной культуры

0 при температуре выращивания 25 С

17 мм. Активность фермента каталазы на 1 г биомассы 11,2 — 11,5 мг Н О за 30 мин. На среде MIIA или ПА рост полностью отсутствует.

Синтетическая среда Норриса с дрожжевым экстрактом. Колонии гладкие (Форма S) с ровными краями. Диаметр пятисуточной культуры 16-18 мм.

Отношение к источнику углерода.

Усваивают глюкозу, сахарозу, галактозу, мальтозу, лактозу, рафинозу, маннит с небольшим подкислением среды.

Лучше всего усваивает сахарозу на

1555320 агаризованных средах, давая более плотную биомассу.

Отношение к источникам азота. Использует азот NH@NO, (NH ) ВО+, KN0> и карбамида СО(ИН )

Молоко пептонизирует с образованием прозрачного "кольца" на поверхности среды, которую подщслачивают до рН 7,8,.

Крахмал и клетчатку не гидролизует.

Нитраты восстанавливает.

Температурный оптимум роста 27,5 С, Оптимальная реакция среды рН 6,5.

На синтетической среде Норриса наблюдается рост при рН 4,4-10,0.

Штамм P 99 хранится на косом бобовом агаре в биологических пробирках при температуре 5 С. Ежегодно проводятся два пересева на бобовом агаре и мясо-пептонном arape (ИПА) для ус-. тановления чистоты культуры.

Эффективность нового штамма P 99 по сравнению с известными штаммами

348а и 329б клубеньковых бактерий клевера изучали продолжительное время Heгетационными (1976-1980 rr)..и полевыми (1980-1987 гг) опытами в условиях дерново-подзолистых глеевых легких суглинков (рН 5,2-6,0) . Возt1 делывали луговой клевер сорта Лепсна", норма высева семян — 16 кг/ra из расчета 1 00% хозяйственной годнос.ти. Подопытные почвы удобряли фосфорно-калийными удобрениями по

60 кг/га Р<А .и К О.

В условиях вегетационных опытов штамм Р 99 при инокуляции повысил урожай абсолютно сухой массы клевера на. 25% по сравнению с производствен40 ными штаммами. Аналогичные. результаты получены и в полевых опытах, где новый штамм дал прибавку урожая абсолютно сухой массы на 6,8 ц/га, с тем

45 как производственные штаммы дают от 3,1 до 5,4 ц/га (табл.1) .

Инокуляция не имела существенного значення на процентное содержание сырого белка в урожае. Тем не менее, при положительном действии инокуля- 50 ции нового штамма на урожай общий сбор сырого белка при этом значительно превышал .уровень контрольных и инокулированных производственными штаммами растений: прибавка сырого белка составила 1,5 ц/га по сравнению с неинокулированными растениями. В то же время производственные штаммы способствовали прибавке белка в среднем на 0,4 ц/га.

Следует отметить, что штамм Р 99 ( образовывал на корнях несколько меньше клубеньков (227 единиц на одном рас: стоянии), чем более вирулентный производственный штамм 348а, но превысил другой производственный штамм 329б.

Пример 1. Жидкую культуру клубеньковых бактерий выращивают в питательной среде следующего состава, %: кукурузный экстракт 1,0; (NH ) 04

0,05; сахар 1,0; К НРО4- ЗН О 0,05;

MgS04 7Н О 0,02; NaC1 0,02; мел 0,1.

Стерилизация - 1,0 атм, 30 мин, рН. после стерилизации 7,0.

Культуру разводят охлажденной стерильной водой и смешивают с нейтрализованным нестерильным торфом из расчета 1,0 r препарата — 0,7- — 1,0млрц. клеток бактерий при влажности 50%.

Для улучшения условий роста и выживаемости клубеньковых бактерий в торф вносят мелассу в количестве 6% от веса сухого торфа. Препарат помещают в специальные кюветы по 10-15 кг или в пакеты по 1,0 кг и выдерживают в течение 5 сут при 20 С. Затем прео парат перемещают и расфасовывают по

200-1000 r в пакетах полиэтиленовой пленки толщиною 40-80 мк, которые запаивают и хранят при 5 С. ь

В течение 12 мес титр клеток клубеньковьгх бактерий составил 2,5 млрд/г препарата.

Пример 2. Инокуляцию стерильного торфа проводят иньекцией культуральной жидкости непосредственно в пакет. Торф влажностью 30% с добавкой мела расфасовывают в пакеты по

О, 16; 0,33 и 0,80 кг (из расчета получения 1,2 и 5 га/порций препарата) при коэффициенте заполнения 0 5-0,7.

Пакеты запаивают; упаковывают в картонные коробки и стерилизуют гаммалучами (2,5 Мрад). Стерильный торф инокулируют иньекцией жидкой культуры непосредственно в пакет. Инокулюм вносят из расчета 1,2 млрд/г бактерий при 60% влажности препарата. Отверстие от укола заклеивают клейкой лентой. В качестве питательной добавки при производстве препарата вносят

6% мелассы от веса сухого торфа. При

12 мес хранения ризоторфина титр сохраняется в среднем 4,5 млрд клеток/г препарата.

51555320

Варианты

Вегетационные опыты

1976-1980 гг. сырой белок в урожае урожай абсолютвес абсолютно сухой массы клевера, г/сосуд сырой белок количеств урожае во клубеньков но сухой массы ц/га г/сосуд на одном растении чистого клевера, ц/га

16,62 11 2

16,11 11,3

19,79 1,88 134

19,58 3,31 285

67,3

16,9

70,4

3,40 201

3,74 227

72, 7 16,52 12,,0

16,9

20, l2

19, 38

74,1

19,3

17, 13 12,7

Н СР954/

T %

0,10 35

3,2 5,8

1,3

2,9

0,9

1,3

О, l6

1,4

Таблица2

Сырой б.елок в урожае

Урожай абсолютно сухой массы чистого клевера, ц/га

Варианты

Е ц/га

11,6

12,0

12,8

13,2

0,3

66,9

69,9

73,7

73,7

2,2

1,1

17,31

17,11

17,93

17,93

При изучении эффективности штамMDB клубеньковых бактерий используют торфяные препараты этих бактерий в виде ризоторфина; Проводят инокуля, цию семян лугового клевера с исходным титром 450х10 клеток на гектарное количество семян или 50х10 кле3 ток на одно семя.

В табл.2 показано влияние инокуляции лугового клевера различными

1 штаммами P&izobium trifolii в полевых опытах.

Контроль (без инокуляции)

Производственный штамм 348а

Производственный штамм 329б

Предлагаемый штамм

Контроль (без инокуляции)

Производственный штамм 348а

Производственный штамм 332б

Штамм P-99

Ю т Х

Как видно из табл.2, в этой.серии полевых опытов штамм P-99 также показал хорошие результаты. Ло эффективности он превысил штамм 332б на

2,6 ц/га урожай абсолютно сухой массы или на 6,8 ц/га по сравнению с контролем.

Формула изобретения

Штамм бактерий Rhizobium trifoli

ВНИИСХИ-1360, используемый для получения нитрагина под клевер луговой. г

Таблица 1

Полевые опыты 1980-1987 гг.