Штамм бактерий сiтrовастеr freundii для биотрансформации фумарата в l-яблочную кислоту

 

Изобретение относится к производству органических кислот микробиологическим способом и может быть использовано в микробиологической, медицинской и пищевой отраслях промышленности, в парфюмерии и металлургии / в качестве комплексообразователя при извлечении некоторых металлов/. Целью изобретения является штамм бактерий CITROBACTER FREUNDII ВКПМNВ-4090, обладающий высокой синтезирующей активностью, стабильностью биосинтеза, более высокой степенью конверсии субстрата в L -яблочную кислоту, что позволит повысить выход целевого продукта. Штамм обладает высоким, относительно стабильным уровнем фумарат - гидратазы, активность которой мало зависит от возраста и условий выращивания культуры. Это позволяет получать более 99% целевого продукта от потребленного количества субстрата. За счет роста предлагаемого штамма бактерий на среде с 3% ферментолизата БВК и последующей иммобилизации нативных клеток бактерий в каррагинан выход целевого продукта повышается. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (19) (I1) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4282710/31-13 (22) 13.07 87 (46) 23.11.89. Бюл. ) 43 (71) МГУ им. М.В.Ломоносова (72) Е.Н.Кондратьева, Н.С.Егоров, И.В.Авсюк и М.Б.Куплетская (53) 547.476:576.851.13 (088.8) (56) Патент C(JA I 3980520, кл. 195-30, 1979.

Патент ФРГ V 2363285, кл. 6b16/02, 1979. (54) ШТАММ БАКТЕРИИ СТТРОВАСТЕК

FREUNDj:I ДЛЯ БИОТРАНСФОРМАЦИИ ФУМАРАТА В Ь-ЯБЛОЧНУМ) КИСЛОТУ (57) Изобретение относится к производству органических кислот микроЬиологическим способом и может быть использовано в микробиологической, медицинской и пищевой отраслях промышленности, в парфюмерии и металлургйи .(в качестве комплексообразователя

Изобретение относится к биотехнологии, к производству органических кислот микробиологическим способом и может быть применено в микробиоло гической, медицинской, пищевой промышленности, в парфюмерии и металлур- гии (в качестве комплексообразователя при извлечении некоторых металлов).

Цель изобретения — штамм бактерий рода Citrobacter freundii (штамм

3Г), обладающий высокой синтезирующей активностью, стабильностью биосинтеза, независящей от возраста культуры, более высокой степенью конверсии субстрата в I.-яблочную кислоту, что поз, (51)4 С 12 N 1/20 9/88, С 12 Р 7/46

2 при извлечении некоторых металлов).

Целью изобретения является штамм бактерий Citrobacter freundii ВКПМ Р В4090, обладающий высокой синтезирующей активностью, стабильностью биосинтеза, Ьолее высокой степенью конверсии суЬстрата в L-яблочную кислоту, что позволит повысить выход целевого продукта. Штамм обладает высоким, относительно стабильным уровнем Фумарат-гидратазы, активность которой мало зависит от возраста и условий выращивания культуры. Это позволяет получать более 99 целевого продукта от потребленного количества суЬстрата. 3а счет роста предлагаемого штамма бактерий на среде с 3I ферментолиэата БВК и последующей иммобилизации нативных клеток бактерий в каррагинан выход целевого продукта повышается.

1 табл. воляет повысить выход целевого продукта.

Штамм Citrobacter freundii 3Г получен из природных субстратов (огородные почвы) в результате селекции на среде с формиатом и депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИГенетика и имеет регистрационный номер В-4090.

Штамм Citrobacter freundii ВКПМ

Р В-4090 характеризуется следующими признаками.

Морфологические и физиологические признаки.

Клетки бактерий представляют собой грамотрицательные подвижные перитри1523569

15. хиальные палочки с закругленными концами размером 0,4-0,5 х 1«2 нм, капсул и спор не образуют. Факультативные анаэробы. Оптимальный рост наблюдается при 25-30 С. Односуточные колонии на мясо-пептонном агаре (МПА) круглые, блестящие, прозрачные, однотипные, с ровными краями, диаметром

1-2 мм, позднее - серовато-белые, блестящие. При росте на твердых средах вокруг колоний на 3-7-е сут, появляются концентрические круги в, виде швермеров.

Рост на мясо-пептонном бульоне (МПБ) обильный, в виде мути,. с серо" ватым оттенком, пленки не образует, в старых культурах муть, осадок. В

24-часовых культурах образование индола не наблюдается. Сероводород. о6 20 разует.

Штамм растет на жидкой среде из

23-ного муравьинокислого кальция и 0,5ь-ного пептона. При этом дает муть по асей пробирке, образует газ и плотную пленку мела на поверхности среды за счет разложения муравьиной кислоты.

При росте на молоке происходит подкисление и коагуляция. Рост на картофельном агаре в виде серовато- белого налета. Культура обладает ха" рактерным запахом. Иелатину не разжижает.

Отношение к углеводам. Разлагает с образованием кислоты и газа глюко- З5 зу, фруктозу, галактозу, арабинозу, маннит, ксилозу, крахмал. Лактозу сбраживает медленно. Не растет на сахарозе, декстрине, дульците, инозите. Использует в качестве источника углерода пируват, формиат, фумарат, глицерин. KNC рост не ингибирует. Ма" лонат не использует, может расти на средах, содержащих в качестве единственного источника углерода 1Ж .лимон- 4>

1 ной кислот ы, Отношение к азотистым веществам.

Хорошо растет за счет аммонийного и аминного азота, пептона. Нитраты восстанавливает до нитритов ° Обладает каталазной активностью.

Штамм хорошо растет на лабораторных средах. Не испытывает потребности, в факторах роста. Выращивание бактерий длится от 9 до 36 ч, лучше 12 18 ч, при значениях величинй рН 6,88,0 (лучше при 7,0-7,2) и температуре

20-37 С (лучше при 25-30 С).

Условия хранения штамма на твердых средах (МПА) под слоем стерильного вазелинового масла или в лиофилизо" ванном состоянии.

Пример 1. Односуточные клетки бактерий С.freundii BKlll Н S-4090 смывают с поверхности МПА 1-2 мл жидкой стерильной водопроводной воды и с помощью стерильной пипетки переносят в стерильную посевную жидкую среду того же состава (МПБ), начальное значение величины рН которой равно

7,0-7,2. Культуру выращивают 10-12 ч при 28-30 С в качалочных колбах емкостью 750 мл (объем среды 50 мл).

Затем посевной материал в количестве

2-33 вносят в среду того же состава и выращивают в течение 9-72 ч тем же способом, в аналогичных качалочных колбах с объемом среды 125 мл. Клетки отделяют от среды центрифугированием при 8000 об./мин в течение 10 мин, Биомассу суспендируют в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,8) из расчета

6-16 мг белка клеток бактерий в 1 мл суспейзии. Определение фумарат-гидратазной активности клеток бактерий проводят известным способом по количеству образовавшейся L-яблочной кис": лоты из фумарата калия. Реакцию синтеза молочной кислоты проводят в течение 1 ч при 37 С на качалке при

175 об./мин.

Удельная активность фумаразы 9часовых клеток бактерий С.freundii

3 г равна 2,6 ° 10 ММ яблочной кислоты на мг белка.за 1 с, что соответствует

97,93 от потребленного фумарата; у клеток 24-часовой культуры 3,1 .10 мМ яблочной кислоты (99,2Ф от потребленного фумарата), у 48-часовой культуры - 3,0 !О мМ яблочной кислоты (98,93 от потребленного фумарата) и у

72-часовых клеток 2,9 0 мМ мг с-<, что соответствует 98,3Ф превращению фумарата в малат.

Результаты сравнения фумаратной активности штамма с известным штаммом Paracolobacter аеговепоЫез Т 743 при инкубации целых клеток бактерий с фумаратом калия в течение 1 ч представлены в таблице.

Пример 2. Выращивание биомассы клеток бактерий С.freundii ВКПМ

Р В-4090 проводят, как описано в примере 1 в течение !2-14 ч.

Реакционная смесь для синтеза яблочной кислоты содержит в 1 мл

5 1523569

1,65 мг белка клеток, либо 3,3 мг белка, лиЬо 4,95 мг белка клеток бактерий.. Определение фумарат-гидратазной активности проводят известным способом. Потребление фумарата от его исходного количества в реакционной смеси составляет соответственно

52,8, 76,8 либо 79,24 с глубиной превращения потребленного фумарата в яблочную кислоту> равной соответственно 87,2 либо 95,3, либо 99,2Ф.

Удельная активность фумаразы клеток С.freundii ВКПМ 11 В-4090 в зависимости от количества белка, содержа- !5 щегося в 1 мл реакционной смеси,соответственно равна либо 5,1.10, либо

3,7 -10, либо 2,6 ° 10 мИ на 1 мг белка за 1 с.

Пример 3. Односуточные клетки 2р

С.freundii ВКПИ O В-4090 смывают с поверхности агаризованной (1,5 ь агара) среды из ферментолизата биомассы микроорганизмов, выросших на углеводородах (31 ферментолизата БВК в водопроводной воде) 1-2 мл жидкой питательной среды того же состава и с помощью стерильной пипетки переносят в жидкую посевную среду того же сос( тава (начальное значение рН 7,2).

Культуру выращивают 10-12 ч при 2830 С в качалочных колбах емкостью

750 мл с объемом среды 50 мл. Затем посевной материал в количестве 2-34 вносят в среду того же состава и выращивают культуру 12-16 ч тем же способом в аналогичных качалочных колбах с объемом среды 125 мл. Клетки отделяют от среды центрифугированием при 8000 об./мин в течение

10 мин.

Биомассу суспендируют в О,OI M фосфатном буфере рН 7,5 (6-20 мг белка клеток бактерий в 1 мл суспензии) и определяют активность фумарат45 гидратазы известным методом.

Удельная активность фумаразы 12часовых клеток бактерий С,freundii, выросших на среде в 3% ферментолизата БВК,равна 2,4 1О мИ яблочной кислоты на l мг Ьелка клеток бактерий за 1 с, что соответствует 991-ному . превращению потребленного фумарата.

Пример 4. Односуточные клетки бактерий С.freundii ВКПИ Г В-4090

55 смывают с поверхности агаризованнои (1,54 агара) среды ИПА 1-2 мл стерильной водопроводной воды и с помощью стерильной пипетки переносят в стерильную синтетическую среду со значением величины рН 7,2, приготовленную на дистиллированной воде,следующего состава, 3: Na>HPO 1,64;

КН РО 0,15; (ИН ),В0 0,2; MgSOg

° 7Н О 0,02 СаС1д 6Н<0 0,01; FeS04, 0,00005; Ип+, Zn+, Со+ следы; глюкоза либо глицерин 1,0, Культуру выращивают 24 ч при 28-30 С в качалочных колбах емкостью 750 мл с объемом среды 50 мл. Затем посевной материал в количестве 3-54 вносят в стерильную. жидкую среду того же состава в аналогичные качалочные колбы с объемом среды 125 мл и выращивают при той же температуре в течение 3048 ч.

Клетки отделяют от среды центрифугированием при 8000 об,/мин в течение

10 мин, затем биомассу суспендируют в 0,01 И фосфатном буфере при рН 7,5 из расчета 10-20 мг белка клеток бактерий и определяют активность фумаратгидротазы известным методом.

Удельная активность фумаразы клеток бактерий С.freundii ВКПИ Г В-4090, выросших на синтетической среде с глюкозой либо с глицерином соответст7 венно равна 2,9 10 и 2,1 1О мИ яблочной кислоты на 1 мг клеток бакте" рий за 1 с.

Пример 5. Вырацивание биомассы бактерий С.freundii ВКПИ Г В-4090 проводят либо на МПБ, как описано в примере 1, либо на среде с 3: ферментолизата БВК, как описано в примере 3.

Исходная удельная фумарат-гидратазная активность клеток бактерий С.freundii, выросших на среде с ИПБ, равня" лась 8,1 ° 10 и на среде с ферментолизатом БВК 5, 7-! О мИ мг с .

Часть оЬъема суспензии клеток бактерий хранят в течение 7 сут при (-4) — (6) С в фосфатном буфере. Ло истечении указанного времени удельная активность фумаразы клеток бактерий, выросших на MILE, составляет 82,7i, а на среде с ферментолизатом БВК 61,43 от исходной удельной активности клеток бактерий.

Другую пбловину объема суспензии клеток Ьактерий С.freundii хранят в течение 7 сут при (-4) - (6)" С в растворе фумарата. По истечении указанного времени удельная ферментативная активность клеток, выросших на ИПБ, составляет 108,6 ь, а на среде с фер15235 ментолизатом БВК 98,03 от исходной удельной активности клеток бактерий.

Пример 6. Выращивание биомассы бактерий С.freundii ВКПМ Р В- т

4090 проводят на МПБ, как описано в примере 1.

Полученную суспензию клеток делят пополам и в одной порции определяют удельную активность фумарат-гидратазы, которую принимают за 100 .

Из другой порции суспензии клеток готовят биокатализатор путем иммобилизации нативных клеток бактерий

С.freundii в каррагинан. Для этого

6 мл физиологического раствора (0,853 5

NaC1 в дистиллированной воде) помещают в стеклянный химический стакан емкостью 500 мл и добавляют 0,35 r каррагинана. Суспензию каррагинана в физиологическом растворе оставляют на 30-40 мин при комнатной температуре (18-22 C) для набухания. По истечении указанного времени суспензию нагревают на водяной бане до полного о растворения каррагинана (70-90 С).

Полученный раствор охлаждают до 4547 С и добавляют 1 мл суспензии кледукта в виде L-аспарагиновой кислоты составляет от 0-0,3 до 2,1-2,4,.

Пример 7. Выращивание биомассы бактерий С.freundii ВКПМ и В-4090 проводят на среде с ферментолизатом

БВК, как описано в примере 3, Полученную суспензию клеток делят пополам и в одной порции суспензии определяют исходную удельную фумаразную активность, которую принимают за

1003.

Из другой половины суспензии клеток бактерий готовят Ьиокатализатор путем иммобилизации нативных клеток бактерий в каррагинан, как описано в примере 6.

Полученный таким образом биокатализатор содержит О,l028 мг белка в

1 мл реакционной смеси и проявляет удельную активность, равную 2903 от исходной активности нативных клеток. формула и з о б р е т е н и я

Штамм Ьактерии Citrobacter freundii ВКПМ Р В-4090 для биотрансформа- ции фумарата в L"ÿáëo÷íóþ кислоту.

Параметры

Paraco1obacter aего"

genoides

Ь" 743

С.,freundii

ВКПМ М В4090

26,0

60,9

60,9

5,2

5,87

0,21 ток бактерий, быстро тщательно перемешивают и смесь охлаждают в течение

10 мин на ледяной бане или в морозил- 0 ке холодильника. Блок иммобилизованных клеток переносят B стеклянный химический стакан емкостью 400 мл, содержащий 300 мл 0,3 М КС1, и выдерживают в течение 1б ч при комнатной 35 температуре для увеличения жесткости геля. По истечении указанного времени полученный блок геля с иммобилизованными клетками бактерий протирают че- рез сито с диаметром ячеек 1 мл. llo- 40 лученные гранулы биокатализатора промывают 2-3 раза 0,05 М фосфатным буфером с рН 7,5. Определение фумарат-, гидратазной активности проводят известным методом по потреЬлению фума- 45 рата и оЬразованию L-яблочной кис лоты.

Полученный таким образом биокатапизатор содержал 0,8202 мг белка клеток бактерий в 1 мл реакционной 50 смеси и проявляет активность, равную

1803 от исходной.

При иммобилизации в каррагинан количество образования побочного про(Время инкубации клеток,ч

Образование яблочной кислоты, г/л

Превращение фумарата в яблочную кислоту, 4

Скорость трансформации фумарата в яблочную кислоту, г/лч

Удельная активность, r яблочной кислоты"г- сухой биомассы мин"