Способ определения глюкозы в биологических жидкостях

 

Изобретение относится к медицине , в частности, к клинической химии. Целью изобретения является повышение точности способа за счет стабилизации окраски реакционной смеси. Для этого в раствор буферного вещества добавляют глюкозооксидазу, пероксидазу, 4 -аминофеназон и азид натрия. Параллельно готовят вещество, взаимодействующее с 4-аминофеназоном, -тимол, растворенный в этаноле. Затем оба раствора смешивают в соотношении 4:1 соответственно. Реактив добавляют в биологическую жидкость и инкубируют смесь, а затем ее спектрофотометрируют. Способ позволяет с высокой чувствительностью ±0,17 ммоль/л (по отношению к глюкозе), точностью ±0,09 ммоль/л (по отношению к глюкозе) и невысокой погрешностью ±0,35% (по отношению к глюкозе) определять концентрацию глюкозы в биологических жидкостях. 2 ил.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (П 4 С 12 g 1/54

ВСЕСОЮ

ПАТЕНТНО- Т

БИБЛИ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К IlATEHTY

ГОСУДРРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР! (21) 3 786908/28-14 (22) 31.08.84 (31) 3059/83

{32) 02.09.83 (33) HU (46) 30.08.89. Бюл. N 32 (71) Реанал Финомведьсердьяр (HU) (72) Ференц Фараго, Тамаш Янчо, Иван Дароци и Габриелла Зайка (HU) (53) 6 16.07 (088.8) (56) Trinder P. — Ann Clin. Biochem., 1968, 6. 24. (54) СПОСОБ ОПРГДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ В

БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ (57) Изобретение относится к медицине в частности к клинической химии.

Цель изобретения — повышение точности способа за счет стабилизации окраски

Изобретение относится к медицине, н частности к клинической химии.

Целью изобретения лвляется повышение точности способа за счет стабилизации окраски реакционной смеси.

На Фиг. 1 поивечен гоаФик, на котором пока..iан линейный характер KDH вой пои измерении концснтоации глюкозы на Фиг. 2 — кривые окоаски реак)

IIHoHHoH смеси в соавнении с иэвестными методами.

Способ осуществляют следующим образом.

Способ основан на том что, если для обвазований кпаслшего вещества t использовать 4-аминоФеназон и тимол то nDH оптимальных чсловиях имеет

„,SU,, 1505444 А 5

2 реакционной смеси. Для этого в раствор буферного вещества добавляют глюкозооксидазу, пероксидазу, 4-аминофеназон и аэид натрия. Параллельно готовят вещество, взаимодействующее с 4-аминофеназоном, — тимол, . раство ренный в зтаноле. Затем оба раствора смешивают п соотношении 4:1 соотнетственно. Реактив добавляют в биологическую жидкость и инкубируют смесь, а затем ее спектрофотометрируют.

Способ позволяет с высокои чувствительностью + 0,17 ммоль/л (по отношению к глюкозе), точностью +0,09 ммоль/л (по отношению к глюкозе) и невысокой погрешностью + 0,357. (по отношению к глюкозе) опр едел ят ь концентрацию глюкозы в биологических жидкостях.

2 ил. место xnnovlo неализчемал (стабильная линейная характеристика, неччвствительность к свету) фотометрическая реакция с высокой чувствительностью.о

Согласно предпочтительному варианту способа тимол растворяют в низ— шем спирте. предпочтительно в этаноле; другие химические вещества растворяют в дистиллированной воде, а спиртоной и водный растворы смешивают друг с другом в соотношении

1:4. Полученный таким образом реактив содержит тимол в концентрации

2, 5+ О, 2 ммол ь/и .

Концентрация др угих химических вещест в н реактиве следующая:

1505444

0.8+ 0, 2 Ко!ьце итра ции 4-ами))офе))аз она приводятся «табл .. Измерения в этом

2, 50 слу>!ае также производят с раствором глюкозы и раствором тимола концентрацие)"! 2, 5 ммоль/л.

Согласяо данным табл.2, макс!!маль55 пая, бол ьше Je»aменяющаяся экстипкция и(лу i,) ется при концентрации 4-а ми нофе !га з о яа О, 600 ммоль/л . Для больян!и наг!ежности в качестве оптпФосф;! т)!1 !!"1 буфер, Л!СЦ!1 /JI 0,08+0 02

4-А ми !)офе а з оп, ММО I«/Jl

Азии натрия ммол ь/л 9.85+0 1

Эт err()н, ммол ь/л 330.0+20

Тимол и 4-аминофеназон соединяют с определяемь!ми субстаициями в необходимых концентрациях в буферном ве» ществе. В результате вследствие специфических фермеитативпых реакций образуется перекись водорода. Из образу)ощейся перекиси водорода освобожда- 15 ется с помощью пероксидазы кислород, который образует 4-(2 -изопропил-5

I l

-метил-1,4 -бен зохивоимопоимино) -фе)

)газон (т.е. красящее вещество).

11р одлагаемый способ отличается тем Zp

) что цветная реакция происходит в опp(.p(.JzeIIrIo!! рН-области (рН 7,0-8,0, предпочтительпо 7, 5), л!аксил!ул! поглэше!и!я света полученпого красящего вещества падает на волновой диапазои 25

465-480 í"r, поэтому целесообразно фоз ол!е гри !есн)!е измерения проводить в ) ТОл! дl! Ii);! з 011(в част цОсти lга D(JJI не 175 «м. Особенно важно, что опрепе !яемыи фотом .грически цвет об- 30 разуется cp««)IIITeльпо быстро. Ус "a«и«лоло, что стаб!!льиый цвет при ком-! латной тем!)ературе появляется в тео че!!))е 25 rlrrrr> а при 37 с — через

15 мип. Цл)1 установле оптимальн го зна )е)п!я pll могут быть использованы различ яые буферы (трис-фосфат, 1 1,! НРО } 11 РО,з, 1. НГО КНГО и

1. борат натрия — НС1).

Растворять тимал необходимо в гле- 40 та поле, этаноле (предпочтительно) или изопро!гаиоле, Коицептрации тимола приведены в табл. 1.

Очевидно, что в случае двух растворО« глюхоэь! на BbicrrIQH, больше не 45 возрастающая экстинкция (интенсивность окраски) по.!учается при концентрации тил!О)!а 2, 5 ммоль/л.

M;l. 1 ь)1(>1! !1 р и )lи лl!1 (тс Я к О fli)E. IITp« !!ия

О, 8!)О ммо. (ь/:! .

Коl)це 1)тра ция пере к ис 11, Тр ("б у(.лла Я для измерения г.;)к)козы, также оптимиэ)!руется (см. табл. 3) . Or>тимальпой является конце)!трацпя 15 Еlмл (1:; — между пар од па я еди ница — количество, которое заменяет 1 ммо If> субстрата в течение 1 мин) . Использов,зние пероксидаза не может содержать другие ферментные !)рил!еси в концентрациях, оказывающих вредпое воздействие.

Из табл. 3 видно, что максимальная интенсивность (экстинкция) полученного с глюкозой цвета достигается уже при ферментной активности

14:Е/мл; для большей надежности берется акти внос т). 1» Е/!!Jr.

)1ри опрец эле! ии холестерина примеияется дстергеп>, чтобы повысить рас гвор)!л!О(:ть. С этой целью может быть использован 9-лаури!!э(1зирполиеканол (Сигма, СШ,(), Тритон Х-100 ок гил,>e) roJIII оззиэ тип енгликол ьэфир, ОВЛ, Австрия) или Бридж 35 (полиоксиэтиленлаурилэфир, ВЕ, Англия) .

Диа rasorr оптпл!аз!Ь))ых концентраций вышеук(ззa))и1)x веществ составляет

0,4 — 1,2/.

Пример 1, Определение глюк(>::ь! в сыворотке крови.

Раствор А. В 0,1 моль/л раствора фос 1)()т))ого буфера (рН 7, 5; Иа HP04 °

2Н О и КН Р04) растворяют следующие вещества:

Глюкозооксидаза, Е/мл 12,5

Цероксидаза, L/rrJI 18,0

- )-Аминофеназон, ммол ь/л 10,0

Лзид иатрия, ммол ь/л 12,3

Раствор В. 12.5 ммоль/л тимола в 96Х-м этаполе (с дистиззлирова)1но!! водой) .

Реактив приготовляют путем смеши«ания растворов А и В в соотношении

4:1.

Стандартизация производится с помощью I 1, 1 ммоль/л раствора глюкозы (н иасыщеп!)ой без нагревапия бензой1i0r кислоте) .

В пробирных трубочках уравновешинают по 3,0 мл реактива, 0 02 лп ставдарта и в других трубочках 0,02 мг) сыворотки крови. Вещества перемешиг)ают и выдсрживают при комнатной тем5 1505444 пературс 30 мин или при 37 С 15 мин.

В последнем случае цвет, образовавшийся после 10-минутного охлаждения

7 фотометри вски сравнивают с холостым опытом (то а на кюветы 1 см, длина волны 475 нм) .

Концентрация > сыворотки крови (в глюкозе, ммоль/л) рассчитывают по следующей формуле:

12000

0,8

8000

12,3

2,5

2,5

12000

12,3

2,5

Экстинкция пробы

11э1

Стандартная экстинкция

Процесс характеризуется линейностью в диапазоне 0-30 ммоль/л. .Пример 2. Для определения содержания глюкозы в сыворотке крови применяют реакционный раствор следу- 20 ющего состава:

Фосфатный буфер мол b/л 0,09

Глюкоэооксидаза, NE/л 25

Пероксидаза, NE/ë 15000

Ти мол, ммол ь/л 2,5

4-Аминофеназон, ммоль/л 0,8 30

Азид натрия, ммоль/л

Эта нол. моль/л

Детергент (Brij-35), 2,5

Значение рН реакционного раство35 ра составляет 7,5 0,2.

Смесь пробы сыворотки крови и реакционного раствора инкубируют, после этого определяют концентрацию глю- 40 козы спектрофотометрически при длине вол ны 4 7 5-48 5 им.

Пример 3. Для определения сосодержания глюкозы в спинномозговой жидкости применяют реакционный раствор следующего состава:

Фосфатный буфер, моль/л 0,09

Глюкозооксидаза, NE/ë

Пероксидаза, NE/ë 15000

Азид натрия, ммоль/л

4-Аминофеназон, ммол ь/л 0,8

Тимол, ммол ь/л 2,5

Детергент (Brij-35), 7

Исследуемую пробу пентрифугируют и после этого напасадочную жидкость без разбавления смешивают с реакционным раствором (рЦ 7,5+0,2). Затем концентрацию глюкозы определяют фотометрически при длине волны 475-485 нм.

Пример 4. Для определения содержания глюкозы в моче применяли реакционный раствор следующего состава:

Фосфатный буфер, мол ь/л 0,09

Глюкоз оок сида эа, NE/ë

Пероксидаза, NE/л 15000

Тимол, ммоль/л 2,5

4-Аминофеназон, ммол ь/л

Аэид натрия, ммоль/л 12,3

Этанол, моль/л 2,5

Детергент (Brij-35), 7 2,5

Значение рН реакционного раствора составляло 7, 5+0, 2.

Исследуемую пробу мочи разбавляли дистиллированной водой до 30-кратного первоначального объема. Смесь разбавленной пробы и реакционного раствора чнкубировали и после этого определяли концентрацию глюкозы спектрофотометрически при длине волны

475-485 нм.

Пример 5. Для определения содержания глюкозы в цельной крови применяли реакционный раствор следующего состава:

Фосфатный буфер, моль/л 0,09

Глюкозооксидаэа, NE/л 12000

Пероксидаза, NE/ë

Тимол, ммоль/л

4-Аминофена з он, ммоль/л 0,8

Аэид натрия, ммоль/л 12,3

Этанол, ммоль/л 2,5

Детергент (Brij-35), Е 2,5

Значение рН реакционного раствора составляло 7, 5 +0, 2 .

Цельную кровь депротеинировали известным способом при помощи раствора трихлоруксусной кислоты, затем приготовили препарат крови в коли!

505444

45

Таблица 1

Тимол, ммоль/л

Экстицкция, 11, 1 ммоль/л

Экстракция, 27,75 ммоль/л

1,330 2,000 2,500 3,000 4,000 5,000

О 330 0,365 О 370 О 370 О 370 О 370

0,750 0,860 0,870 0,870 0,870 0,870 честве, соответствующем десятикратному количеству, указанному в примере 1, и смешивали с реакционным раствором в количестве указанном в приУ

5 мере 1. Смесь инкубировали и после инкубации определяли концентрацию глюкозы спектрофотометрически при длице волны 474-485 нм.

Определение наличия и количественные измерения глюкозы производят в диапазоне концентра > 2, 775"

33,300 ммоль/л. Данные частично сведены в табл. 4 и частично представле- ны на фиг. 1 (в математическом выра- 15 жении) .

Из приведенных данных следует, что измерительная характеристика (в данном диапазоне) является линейной.

Цветная реакция проходит полностью и обеспечивает более точную возможность измерения глюкозы.

Предлагаемый способ сравнивают с эталонным методом, в качестве которого служит известный метод ультра- 25 фиолетовой пробы на гексокицазу Беринга, В качестве раствора, содержа1 щего сахар, в этом случае используются 45 проб человеческой крови (без выбора). Иэ фиг ° 2 видно, что между 30 результатами, полученными этими методами, нет никаких отличий, так как коэффициент корреляции (r = +0,1971) очень близок к теоретическому значению(1,000)икрутизнакривоирегрс35 сии отличается от теоретического значения лишь на 0,4 .

Чувствительность, воспроизводимость и погрешности метода определяются на основании полученных результатов измерения. Такая статистическая обработка дает следующие результаты (по отношению к глюкозе):

Чувствительность, ммоль/л + 0,17

Точность, ммоль/л . О, 09

Погрешность, F. + 0,35

Предлагаемый реактив, кроме того пригоден для количественного определения глюкозы в выделениях человека и животных (иапример в крови, моче, ликворе) и для определения содержания глюкозы в употребЛяемых человеком напитках (например алкогольных напитках, соках, освежающих нанитках) или для измерения других растворов, содержащих глюкозу, холестерин или мочевую кислоту.

Предлагаемый реактив превосходит известные тесты. Из количественного сравнения следует, что при использовании предлагаемого метода цвет ео-г вершенно це меняется в течение по меньшей мере 240 мин, тогда как при использовании известных методов непрерывное снижение интенсивности окраски наблюдается уже через короткое время (45 мин, см. рис. 2).

Формула изобретения

Способ определения глюкозы в биологических жидкостях путем помещения исследуемой пробы в раствор буферного вещества, дополнительно содержащего глюкозооксидазу, пероксидазу, 4-амицофеназон, азид натрия и вещество„ взаимодействующее с 4-аминефе-, цазоцом, инкубации полученной смеси с последующим спектрофотометрировацием„ отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа за счет стабилизации окраски реакционной смеси в качестве вещества, дополнительно взаимодействующего с 4-аминофеназоном, используют тимол в концентрации 2,3-2,7 ммоль/л при этом раствор буферного вещества содержит 0,6-1,0 ммоль/л 4-аминофеназоца, 12, 1-12,5 ммоль /л азида нат" рия, 10000-20000 NE/ë пероксидазы, 8000-20000 ИЕ/л глюкозооксидазы, при рН 7,5+0,2, а измерение проводят при длине волны 475-485 нм.!

5054444

Т а (iл и ц а 2

4-A ми нофе на э он, ммол ь/л

Экстинкция, 11, 1 ммоль/Jl

Экстинкция

27,75 ммоль/л

О, 200 0,400 0,600 0,800 1, 000

0,350 0,370 0,370 0,370 0,370

0,800 О 860 0,870 0,870 О 871

Таблица3

12

15 17

0820 0850 0865 0870 0870 0870

Таблица 4 х, ммол ь/

2 775 5 550 8 в325 11 100

3 3 3 3

0,0950 0,1833 0,2783 0,3683

0,0951 0 !860 0,2769 0,3679

О, 10 — 1,45 +О, 50 +О, 10

П р и м е ч а н и е. х — концентрация уравновешенной глюкозы, и — число параллельных иэмерений; У вЂ” среднее значение измеренных экстинкций; Y — экстинкции, вычисленные из сравнения калиброванных прямых; d — разница между измеренными и вычисленными экстинкциями.

Fq 246895; Р 4= 1,20746; (F.G.: 6; 16) P ) 0,10, где Р— проба регрессии;

à — проба линейности;

F ° G. — степень свободы линейности;

P — достоверность линейности; так как это значение больше, чем 107., кривая отклоФ няется от прямой незначительно. и

Y

d, .

Активность пероксидаэы, Е/мл

Экстинкция, 27,75 ммоль/л

13,875

0,4616

0,4588

+0,61

16,650

0,5500

0,5497

+0,05

22,200

О, 7300

0,73!6

-0,22

27,750 33,300

3 3

0,9133 1, 1210

0,9135 1, 0953

-0,02 +2,32

1 505444 !.1О0

5. 000

0,000

0,600

0,700

О, б00

0,500

0,400

О,ЗОО

0,200

0,100

О,ООО

N Ncf/(Jiva. 1

0400 з сз 0300

0,200

Ь,, . 0,500 апм1ел

Составитель Л. Шилина

Редактор И. Рыбченко Техред А.Кравчук Корректор Т. Малец

Заказ 5274/59 Тираж 501 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 1О!