Способ определения человеческого гемоглобина в фекалиях

 

Изобретение относится к медицине, точнее, к биохимическим методам обнаружения скрытой крови в фекалиях. Целью способа является повышение специфичности и чувствительности способа.Гемоглобин человека выделяют из пробы с помощью иммунохимической реакции, т.е. реакции между антителом и антигеном, при использовании закрепленного в твердой фазе специфического антитела гемоглабина человека. Затем определяют с помощью ферментативной реакции наличие гемоглобина, соединившегося с антителом

СОЮЗ СОВЕТСКИХ социАлистичесних

РЕСПУБЛИН

ВСЕСОЮ

l3ATEHTHQ - T

БЯБЛИ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ пО изОБРетениям и ОтнРытиям

Г1РИ ГННТ СССР (2 I ) 32 354 97/28-1 4 (22) 16. 01. 81 (31) 800140 (32) 17.01,80 (33) FI (46) 23.07.89. Бюл. Ф 27 (71) Коммандииттинхтие Финнпипетте

Осмо А. Суованиеми (FI) (72) Осмо Суованиеми, Херман Адлеркреуц, 10кка Суни и Пол Пар-.àíåí (FI) (53) 616,07(088,8) (56) Патент США Р 4016043, кл. 195-103, опублик. 1977.

Antonius Н.W.N. Shuures, Bauke К, Van Weemen, Gerrit Wolter all of

oss Netherlaud.

"Enzymatic immunological method

for the determination of autigeus

and autibodies.

Изобретение относится к медицине, точнее к биохимическим методам обнаружения скрытой крови при диагностике различных клинически трудно диагностируемых кишечных заболеваний,таких как новообразования толстой и прямой кишки, аденомы, язвы и дивертикулы.

Цель изобретения — повышение специфичности и чувствительности определения.

Способ основывается на двухфазном анализе скрытой крови, соединяющий высокочувствительный анализ с использованием гваяковой смолы с высокоспеI цифическим и чувствительным иммунохимическим анализом, с помощью которого определяется только человечес1 кий гемоглобин. Эта комбинация анали„„sU„, A3 цр 4 G 01 И 33/48 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ГЕМОГЛОБИНА -В ФЕКАЛИЯХ (57) Изобретение относится к медицине, точнее к биохимическим методам обнаружения скрытой крови в фекалиях.

Целью способа является повышение специфичности и чувствительнос ги способа. Гемоглобин человека выделяют из пробы с помощью иммунохимической реакции, т.е, реакции между антителом и антигеном, при использовании закрепленного в твердой фазе специфического антитела гемоглобина человека. Затем определяют с помощью ферментативной реакции наличие гемоглобина, соединившегося с антителом. зов устраняет ложные положительные результаты анализа, а также необходимость в контроле за пищевым режимом.

Необходимое для предлагаемого способа оборудование включает пакет для анализа кала, в который помещают пробу, и второй пакет, имеющий бумажный фильтр. Абсорбент (бумажный фильтр) прикрепляется к оболочке пакета так, что находится между пропитанной гваяковой смолой, бумагой пакета и пластмассовой крышкой..

Когда гемоглобин экстрагируют из абсорбента, получают раствор, содержащий гемоглобин (Нв) и другие растворимые молекулы из кала, этот раствор переносят пипеткой в кювету из набора полистироловых кюветок на

3 1496643 стенкЙ и на дно которой нанесено определенное количество антитела человеческого гемоглобина. Здесь гемоглобин пробы (антиген) связывается с антигемоглобином твердой фазы (IgG). После инкубационного периода, равного. времени протекания иммунологической реакции, кюветку промывают водой для удаления всех несвя- 10 занных веществ.

Твердая фаза может представлять собой полимер, отличный от полистирола, и иметь иную форму, отличную

or кюветы или сосуда, например шари- 15 ка, кольца, диска.

После того как кюветка промыта, в нее помещают определенное количество IgG антитела человеческого гемоглобина, при этом IgG имеет какойлибо фермент в качестве индикатора.

Связывание "помеченного" ферментом

IgG с антителом в твердой фазе зависит от количества "свободных антител" в твердой фазе, оставшихся после обработки пробы. Так, с помощью фермента можно проверить, быт а ли реакция между антителом (анти-НЪ человека) с антигеном (человеческим

Hb) путем добавления субстрата, спе-. цифичного для данного фермента, при этом фермент выделяет из субстрата окрашенное видимое или фотометрически регистрируемое соединение. Количество фермента можно определить ли- 3» бо измеряя количество, соединившееся с твердой фазой, либо количество, оставшееся в растворе свободным.

Анализ РЕСА-EIA позволяет обнаружить только интактный гемоглобин че- 40 ловека, а анализ на основе гваяковой смолы также обнаруживает продукты распада гемоглобина. Кроме того, устраняются ошибки, вызванные присутствием гемоглобинов животных, при- 45 сущие известным способам.

Пример. С лабораторной стороны крышки корпуса пакета берут абсорбент, содержащий пробу, и помещают в кюветку анализатора FP-9. Полистироловая кюветка FP-9 предварительно

"сенсибилизирована" с помощью иммуноглобулиновой фракции антигемоглобина.

200 мкл буферного раствора, содержап1его фосфат (0,1 М полибутадиенстиро; 55 ла, рН,7;4), добавляют в кюветку.

Инкубация, например, 2 ч при +37 С.

Кюветку промывают 400 мкл дистиллированной воды В кюветку добавляют

200 мкл иммуноглобулиновой фракции антигемоглобина человека (полибутадиенстирол в качестве растворителя) с подходящим ферментом, например щелочной фосфатазой (добавка конъюгата). Иикубация, например, в течение 2 ч при 37 С. Промывка аналогичо на, Добавляется субстрат, специфичный для фермента, который используется в конъюгате (паранитрофенилфосо фат). После 30 мин инкубации при +37 С добавляется 200 мкл 0,1 M NaOH для остановки реакции. Результат оценивается фотометрически.

Рекомендуемым пределом прекращения реакции является среднее значение абсорбции (минус контрольное значение), нормальных некровоточащих проб +3 стандартных отклонений или при отсутствии таких данных — 9200 единиц.

Наименьшие количества, обнаруженные посредством этого анализа, составляют 0,05-0,1 мкг цианметгемоглобина (мл 1-5 мкл гемолизированной крови на 1 r фекалий), 140- 700 мкг гемоглобина (г фекалий) и от 2,0 до

5,0 мкл цельной крови (г фекалий (280-700 мкг гемоглобина (г фекалий). формула изобретения

Способ определения человеческого гемоглобина в фекалиях путем иммунохимического анализа, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повьппения специфичности и чувствительности способа,1 г образца адсорбируют через бумагу, пропитанную гваяковой смолой на фильтровальную бумагу, фильтровальную бумагу помещают в измерительную ячейку кюветы, предварительно обработанную в течение 15 ч при 4 С иммуноглобулиновой фракцией человеческого антигемоглобина, добавляют 200 мкл раствора фосфатного буфера рН 7,4, содержащего 0,1 М полибутадиенстирола,инкубируют 2 ч при

37 С, промывают ячейку 400 мкл дисо тиллированной воды, вносят 200 мкл раствора иммуноглобулиновой фракции человеческого антигемоглобина, соединенного с щелЬчной фосфатазой и растворенного в растворе фосфатного буфера, инкубируют 2 ч при 37 С, повторно промывают, добавляют 200 мкл паранитрофенилфосфата и после инку6

1496643 6 бирования в течение 30 мин при 37 С при 405 нм определяют. общий уровень реакцию прекращают с помощью 200 мкл содержания человеческого гемоглор,1 M раствора NaOH и по поглощению бина в образце. !

Составитель Л. Конюхова

Редактор М.Бланар Техред Л.Олийнык Корректор М. Иаксимишинец

Заказ 4290/59 Тирам 789 Подписное

ВЯИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 .Производственно-издательский комбинат "Патент", r.умгород, ул. Гагарина, 101