Способ определения содержания белка
Изобретение относится к микробиологической и комбикормовой промышленности и касается методов контроля содержания истинного белка непосредственно в кормовых дрожжах или в кормосмесях. Цель изобретения - повышение точности определения белка. Способ заключается в том, что проводят предварительную обработку образца ацетоном при 15-55°С в течение 15-30 мин и при отношении исходного образца и растворителя не более 0,5-1,0%, после чего ацетон удаляют, а инкубацию образца с раствором красителя амидочерного 10В проводят при 50-100°С в течение 10-30 мин в дистиллированной воде, причем добавление красителя осуществляют с установлением PH с помощью HCL в пределах 1-3 с последующим фильтрованием и измерением оптической плотности фильтрата при 590 нм. Предлагаемый способ позволяет количественно определять белок в биомассе микроорганизмов с высокой точностью. 12 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
ССН4ИАЛИСТИ1ЕСКИХ
РЕСПУ БЛИН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 4258459/30-13 (22) 08 ° 06.87 (46) 15.07,89 .Бюл. У- 26 (71) Всесоюзный научно-исследовательский и проектно-конструкторский институт микробиологических производств (72) С.Л.Романов, В.В.Котусов, В.В,Орлов, Н.К.Белоцерковская и Н,А.Щербак (53) 577 ° 15(088.8) (56) Бузун Г.А., Джемухадзе К.H., % лешко Л.Ф. Определение белка в растениях с помощью амидочерного.
Физиология растений, 1982, 29,1, с. 198-204..(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ
БЕЛКА (57) Изобретение относится к микробиологической и комбикормовой промышленности и касается методов контИзобретение относится к микробиологической и комбикормовой промышленности и касается, методов контроля содержания истинного белка непосредственно в кормовых дрожжах или в кормосмесях, Целью изобретения является повьш ение точности определения белка, Изобретение заключается в том, что предварительную обработку сухого препарата (биомассы микроорганизмов или продукта микробного синтеза) проводят ацетоном при 15-55 С в течение 15-30 мпн, удаляют ацетон, инкубирун т прс парят при 50-100 С в
„„SU„„1493952 А1 (51)4 G 01 N 33/48 А 23 J 1/00
2 роля содержания истинного белка непосредственно в кормовых дрожжах или в кормосмесях. Цель изобретения — повышение точности определения белка.
Способ заключается в том, что проводят предварительную обработку образца ацетоном при 15-55 С в течение
15-30 мин и при отношении исходного образца и растворителя не более 0 51,0%, после чего ацетон удаляют, а инкубацию образца с раствором красителя амидочерного 10В проводят при
50-100 С в течение 10-30 мин в дистиллированной воде, причем добавление красителя осуществляют с установлением рН с помощью НС1 в пределах
1-3 с последующим фильтрованием и измерением оптической плотности фильтрата при 590 нм. Предлагаемый способ позволяет количественно определять белок в биомассе микроорганизмов с высокой точностью, 12 табл ° течение 10-30 мин в растворе красителя амидочерного 10В в подкисленной с помощью НС1 дистиллированной воде до рН 1-3, а затем фильтруют и измеряют оптическую плотность фильтрата.
В качестве стандартного препарата используют биомассу микроорганизмов или продукт микробного синтеза с заранее определенным содержанием белка с помощью известного метода, например по Барнштейну.
Для определения связывания красителя амидочерного 10В с анализируемым препаратом берут небольшое количество этого препарата (около ?О г),тщау — В
С = -- — — — 100Z9
Ах где С
У содержание белка; значение связывания красителя с белком; соответствующее этому связыванию значение концентрации
55 анализируемого препарата;
14939 тельно растирают в фарфоровой ступке пестиком в течение 10 мин и высушивают при 105" С до постоянного веса (хранят препарат в стеклянном бюксе .с притертой крышкой). Затем делают
5 необходимую навеску препарата, добавляют 15 мл ацетона и перемешивают при комнатной температуре (см.табл.1) в течение 15 мин (см.табл.2) на магнитной мешалке, После этого суспенэию центрифугируют в течение 15 мин при
7000-8000 об/мин, ацетон удаляют декантацией, а осадок высушивают при комнатной температуре в течение 15
5-10 мин. К высушенному от ацетона препарата добавляют 0,01 н НС1, рН 2 (см.табл.3,4) до концентрации пре.парата 5 мг/мл и перемешивают при комнатной температуре на магнитной 2р мешалке в течение 15 мин, Затем не прекращая перемешивание, разносят аликвоты суспензии по пробиркам,доводя объем до 1,5 мл с помощью 0,01 н
НС1, и добавляют в каждую пробирку 25 по 3 мл раствора красителя амидочерного 10В 0,6 г/л в 0,01 í НС1. Далее пробирки помещают в термостат и инкубируют при 60 С (см,табл,5) в течение 20 мин (см,табл.6) при пере- 3р мешивании. После инкубации фильтруют все образцы и контроль (раствор красителя без препарата) через бумажные фильтры на воронках. Фильтраты разбавляют в 25 раз, для чего к 0,2 мл фильтрата добавляют 4,8 мл 0,01 н
НС1, а затем измеряют оптическую плотность D при 590 нм в стеклянных кюветах с длиной оптического пути
1,0 см против 0,01 н НС1. Далее оп- 40 ределяют разницу й0 между оптическими плотностями контроля и опытного образца, Связывание красителя с анализируемым препаратом (разницу между оптическими плотностями) выражают в процентах от оптической плотности фильтрата контроля.
Содержание истинного белка в продуктах микробного синтеза и биомассе микроорганизмов определяют по форму50 ле
52
А и  — эмпирические коэффициенты уравнения калибровочной прямой (у=Ах+В), рассчитанные с помощью метода наименьших квадратов из нескольких параллельных опы- тов по связыванию красителя амидочерного 10В со стандартным препаратом (биомассой микроорганизмов или продуктом микробного синтеза), содержание белка в котором определено с помощью известного метода, например по Барнштейну или по данным аминокислотного анализа.
В табл.1 показано влияние температуры обработки ацетоном препарата кормовых гидролиэных дрожжей с кон- . центрацией 5 мг/мл на связывание красителя амидочерного 10В с ними.
В табл,2 показано влияние времени обработки ацетоном препарата кормовых гидролизных дрожжей на связывание красителя амидочерного 10В с ними.
В табл.3 показано влияние рН раствора красителя амидочерного 10В íà его связывание с кормовыми гидролизными дрожжами, В табл.4 показано связывание кра сителя амидочерного 10В с кормовыми гидролизными дрожжами в зависимости от состава растворителя.
В табл.5 показано влияние температуры инкубации кормовых гидролизных дрожжей с красителем амидочерным 10В на его связывание с дрожжами.
В табл.6 показано влияние времени инкубации кормовых гидролизных дрожжей с красителем амидочерным 10В на его связывание с ними.
П ри ме р. Первоначальным этапом определения белка по предлагаемому способу является определение эмпирических коэффициентов калибровочной прямой (у = Ах + В), т.е. зависимости связывания красителя амидочерного 10В со стандартным препаратом от концентрации в этом препарате истинного белка, который определяли по Барнштейну.
В качестве стандартного препарата для определения белка в биомассе микроорганизмов мы использовали кормовые гидролизные дрожжи с содержанием белка в расчете на сухой вес 41,42Х. Эмпирические коэффициенты А и В определяли по методу наименьших квадратов
5 по данным 5 параллельных опытов (см. табл. 7):
1493952
Содержание белка в анализируемых препаратах определяли по формуле
30,07 °
15
В
N х - (х;)
= 8,11 где А и  — эмпирические коэффициенты калибровочной прямой1 х; — концентрация белка в стандартном препарате; у — опытные значения свяэыl вания красителя с препаратом, соответствующие х;, N — - число измерений.
В табл.7 показано связывание красителя амидочерного 10В со стандартным препаратом кормовых гидролизных дрожжей.
Содержание белка в анализируемых препаратах определяли по формуле ч — 8 11
С = - — — ь — — 100
30,07 х
В качестве анализируемого препарата взяли дрожжи (кормовые гидролиз- 30 ные) с неизвестным содержанием белка (см.табл,8), В табл.8 показано связывание красителя амидочерного 10В с анализируемым препаратом кормовых гидролиз35 ных дрожжей.
В результате проведенных расчетов получили следующие значения содержания белка в анализируемом препарате кормовых гидролиэных дрожжей: 40
С, = 39,99Х; С q = 42,97 .; С э= 41,51 ;
С = 41,49 + 0,63 .
Таким образом, содержание белка в анализируемом препарате кормовых 45 гидролизных дрожжей составляет
41,49 °
Для определения содержания белка в продукте микробного синтеза в качестве стандартного препарата использовали дрожжеванную ржаную муку с содержанием белка по Барнштейну
10,62 (см,табл.9) и белково-витаминный концентрат (БВК) с содержанием белка 55,13% (см,табл,11).
В табл.9 показано связывание кра-i сителя амидочерного 10В со стандартным препаратом дрожжеванной ржаной муки. у -029
С = — — — - -- ° 100X
35,63 . х
В качестве анализируемого препарата мы использовали дрожжеванную ржаную муку (см.табл.10) с неизвестным содержанием белка.
В табл.10 показано связывание красители амидочерного 10В с анализируемым препаратом дрожжеванной ржаной муки.
В результате проведенных расчетов получили следующие значения содержания белка в анализируемом препарате:
С,= 11,07 .; С g = 11,28 .; С = 11,19 ;
Сср 11 18 + 0,07X
Таким образом, содержание белка в анализируемом препарате дрожжеванной ржаной муки составляет 11,18%.
В табл.11 показано связывание красителя амидочерного 10Â со стандартным препаратом белково-витаминного концентрата.
Содержание белка в анализируемых препаратах белково-витаминных концентрациях определяли по формуле у — 14 52
С = — — — — - 100X.
27,09 х
В качестве анализируемого препарата испольэовали белково-витаминный концентрат (см.табл,12) с неизвестным содержанием белка.
В табл.12 показано связывание красителя амидочерного 10В с анализируемым препаратом белково-витаминного концентрата.
В результате проведенных расчетов получили следующие значения содержания белка в анализируемом препарате .белково-витаминного концентрата:
С, = 56,451; С g = 55,88Х; С = 55 ° 96X>
Сср= 56э to + Оъ24X °
Таким образом, содержание белка в анализируемом препарате БВК составляет 56,101.
Формула изобретения
Способ определения содержания белка, предусматривающий предварительную обработку исходного образца, добавление к нему красителя амидочерного 10В с одновременным регулирова- нием рН среды, инкубирование, удале1493952 исходного образца и растворителя
0,5-1,0, после чего ацетон удаляют, а инкубацию образца с раствором кра5 сителя проводят при 50- 100 С в течение 10-30 мин в дистиллированной воде, при этом добавление красителя осуществляют с установлением рН с помощью НС1 в пределах 1-3.
Таблица 1 ние осадка с последующим спектрофотометрическим анализом надосадочной фракции v расчетом содержания белка, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения белка, предварительную обработку образца проводят ацетоном при 15-55 С в течение 15-30 мин и при отношении
РУ Время об- Температура D и/п работки обработки, С мин
Связывание красителя, Х
1 к
3 15
4 15 .5 15
6 15
7 15
8 15
9 15
10 15
11 15
12 15
1,25
0,76
0,72
0,64
0,55
0,51
0,45
0,46
0,48
0,48
0,51
0,51
Контроль (раствор красителя беэ дрожжей).
Опыт без предварительной обработки ацетоном.
Температура кипения ацетона 56,2 С.
Таблица 2
РР Температу- Время обра- D п/п ра обработ- ботки,мин ки, С
Связывание красителя, Х
Таблица 3
Связывание красителя, Х рН раствора красителя
Ю и/п
Оптическа» плотность контроля не зависела от рН в исследованном диапазоне.
1*
3
5
0
5
1,00
0,04
0,04
0 05
0,22
0,34
0,53
1,26
0,76
0,71
0,56
0,45
0,47
0,49
0,48
0 56
О
0,96
0,96
0,95
0,78
0,66
0,47
О
0,49
0,53
0,61
0,7,0
0,74
0,80
0,79
0,77
10, 77
0,74
0,74
0,49
0,54
0,69
0,80
0,78
0,76
0,77
0 69
96
96
78
66
0
100,0
108, 2
124,5
142,9
151,0
163,3
161,2
157,1
157, 1
151,0
151,0
100,0
110,2
140,8.
163,3
159,2
155,1
157,1
140 8
1493952
Таблица 4
Концентрация препарата, мг/мп
УР . п/п
0,01 н НС1 Буферный раствор
63,30
54,20
45, 1О
62,50
54,35
45,65
4,5
3,5
3,0
Буферный раствор содержал 37,65 г/л лимонной кислоты и 1, 136 г/л Na ÍÐÎ .
Таблица 5
Связывание красителя, Х
Время ин- Температура кубации, инкубации, С мин
УВ
n/è
2
4
1,20
0,89
0,70
0,54
0,56
0,57
+ Оптическая плотность контроля не зависела от температуры в исследованном диапазоне.
Таблица 6
99 Температура Время инп/п инкубации, кубации, С мин
Связывание красителя, Х
Таблица 7
Концентрация, мг/мл г белка
Ф п/п
Связывание красителя с препаратом " Х препарата
69, 10+1, 24
62,85т0,87
58,25+1,32
52,9510 80
46,5010,76
37,05 1,00
33,0811,03
2,06
1,85
1,64
1,44
1,23
1,03
0,82 В таблице представлены усредненные значения связывания, полученные из
5 опытов
2
4
6
8
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
5
100
1,20
0,91
0,70
0,65
0,55
0,60
0,62
0,83
0,89
0,31
0 50
0,66
0,64
0,63
0,29
0 50
0,55
0,65
0,60
0,58
0,37
0,31
25,8
41,7
55,0
53,3
52,5
24,2
41,7
45,8
54,2
50,0
48,3
30,8
25,8
1493952
Таблица 8
Связывание красителя, 7
Концентрация препарата, мг/мл
Ф1В п/п
0,56
62,22
0,90
0,34
0,34
0,40
0,44
0,50
0,48
4,5
4,5
3,5
3,5
3,0
3,0
0,34
0,48
53,33
45,56
0,42
0,41
0,49
Таблица 9
Связывание красителя с препаратом, Х
УР п/п белка препарата
1,06
0,96
0,85
0,74
0,64
0 53
0,42 В таблице представлены усредненные значения связывания, полученные из 5 опытов.
Таблица 10
Связывание красителя, X п,р
Концентрация препарата, мг/мл
99 п/п
35,679
0,34
0,61
0,68
0,27
28,42
24,21
0,23
0,72 блица 11
Фг
В таблице представлены усредненные значения связывания, полученные из 5 опытов.
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
8
6
2,76
2,48
2,20
1,93
1,65
1,38
1, 10
0,95
0,60
0,62
0,68
0,68
0,71
0,73
38,49+1,04
34,46+1,00
29,87+0,68
27,09+0,29
22,44+0,34
19,00+0,37
15,98ф0,24
87,40 0,96
82, 1110,82
75,82+0,85
66,31+0,79
60,03т0,61
53,72ф0,80
42,11+0,81
13
1493952
Таблица 12
Связывание красителя, 3 ср
Концентрация препарата, мг/мл
ФР и/и
83,33
1,00
0,20
67,50
60, 00
0,81
0,39
0,48 0,72
Редактор И.Циткина
Заказ 4103/42 Тираж 789 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101
4,5
4,5
3,5
3,5
3,0
3,0
1,20
0,19
0,21
0,40
0,38
0,48
0,48
Составитель В.Варламов
ТехРед Л.Олийнык Корректор Л.Патай
