Способ получения культурального антигена из тriснinеllа spiralis

 

Изобретение относится к биотехнологии ,в частности, к производству препаратов для серологической диагностики трихинеллеза у людей и сельскохозяйственных животных. Целью изобретения является увеличение выхода культурального антигена и повышение его специфичности. Для этого проводят предварительную очистку личинок трихинелл от балластных белков с выделением жизнеспособной фракции личинок центрифугированием в 30-60%-ном градиенте плотности глицерина. Антиген получают при культивировании мышечных личинок трихинелл в течение 48-60 ч при 37°С в растворе Хенкса с антибиотиками и добавлением 0,020 - 0,030 Ед/мл инсулина. Использование предложенного способа позволяет повысить выход трихинеллезного культурального антигена на единицу биомассы трихинелл и увеличить специфичность серологической диагностики трихинеллеза. 2 табл.

СОЮЗ COBE,TÑHÈХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК ((9)SU ((((Ai (д1) 4 А 61 К 39/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К д ВТОРСНОМУ С8ИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblTHRM

ПРИ ГКНТ СССР (21) 433-(827/28-13 (22) 21. 10. 87 (46) 15 07 89 1юл М 26 (71) 1 остов{.кий научно-исследоваге.r(ский»»нститут эпидемиологии, микробиологии, паразитологии и гиги енл{ (72) Г.И. Банер{»н и A.Ô. Костецкий (53) 576.8 097 (088.8) (э»» ) 1 ес ((»{r»r» A .C . .(1иа Г»{ост»»ка три хи.;е I..råза. — 11»»льнюс, 1975. ч. 2, с. 35-71. (54 ) СПОСОБ ПО(1У{1ЕНИЯ КугП»ТУРАЛЬНОГО

АНТИГБНА ИЗ TRLCHINELLA SPIRALlS

<57) Изобретение относится к биотехнологии, н частности к производству препаратов для серологической диагностик»» трихинеллеза у лндей и сельИзобретение относится к, области биотех{{о;гог»{»{, н частности к производству препаратов для серологической дг»аг ноет ики трихинеллеза у людеЙ и сельско.<озг{йстненных животных.

Цг »{ ь и-(пбрете ния — увеличение вы—. хода ку {ь (ура ньного а нтигена и повышение его специфичности.

П р r", rr е р 1. Беспородных белых мышей м{{(ге и 18-?О г заражают мышечнь{ми:{и«{»н{;{ми трихинелл r» J»0»е 50 личинок я:l мын{ь. через 45-60 дней

»ю»{»(»т {и с:, бина ют, костно-мь{шечнук» ткань ri(р(pаринают н растворе искусс T r((»»» ({(({ ((»{(. { («{(»ч»{(»I и с (»ка (ilr. пси н скохозяйственных животных. Целью изобретения я вля ется увеличение r»hlxo да культуральног и антигена и г{с вы{{{ение его специфичности. {1{»я этого проводят п >еднарг{тельную очистку rrrr«>rнок три хи нелл от балласт ных белков с выделением жизнеспособной фракции личинок центрифугир<»ванием в 30—

601-ном градиенте плотности глицерина. Лнтиген получают при культивировании мышечных личинок трихинепл в о течение 48-60 ч при 37 С в растворе

ХрНКсВ с антибиотиками и добавлением 0,020-0,030 Ед/м(» инсулина. Использование предложенного способа позволяет повысить н гход трихинеллез- д

Ю ного культуральногп антигена на единицу биомассы трихинелл и увеличить специфичность серологической диагностики трихинеллеза. 2 Tïáë. С: мед»{цинский 3, 0 г, концентрированная соляная кислота 1,0 мм, дистиллированная вода до 100,0 мл) при 37 С в течение 20-24 ч. Изолированные личинки трихинелл 5 раз отмывают физиологическим раствором и наслаивают н объеме 5,0 мл в количестве 3, 54,0 10 личинок на градиент плотности глицерина (по 10 мл 60, 50, 40 и 307-ного глицерина) . Центрифугирпвание проводят при 1500-2000 об/мин н течение 10 мин. Фракции, расположенные на границе 40-507 и 50-607. глицерина, содержащие только жизнеспособные личинки, собирают, три ра—

149 неллеза.

Концентрация белка P на общее колисество трихинелл, мк? /мл

Доза инсулина (Ед/мл) Доэа три хи н слл (лич . /м>1) с.0,001

41,0+9,1

167,0 .11,1

167,0+11,1

64,0+8,O

0,0125

0,0200

0,ОЗОДИ

0,0500

3,5-4,0 10 с0,001

Тас>лица 2

Вс его

Всего полок иселедоЛнтиген

СреднеТитр антител геометр.

1/20 1/40 1/80 1/160 титр/1о8 и выше в,> но

12

25,026,2 5,5+0,5

ЭВ 33 28 19

79, 0 6, 7 68, 7М, 7 58,0а7, 1 39,Ы 7 > 1

38

79,0+6,7

Коммерческой

Кул ьтурадь>м

13 10 6 4

27,0i6,4 20,0t5,8 12,5+4,8 8,0+3,9 с0,001 с0,001 0,001 с0,001 (.! 7,<>+ 6,4

6,033,4 с09001

1,Ы0,4 с 0,001

>а с» мь впк>т <>т глицерина раствором е>с>сса с антибиотикам>с.

В растворе Хенкса с добавлением канамицина в доче IOO,O мкг/мл и ливорина в дозе 100 мкг/мл добавляют стерильно раствор инсулина до конечной концентрации О, 020-0, 030 Ед/мл.

В приготовленную среду стерильно вносят жизнеспособные личинки трихинелл до конечной концентрации 3.03,5 10З личинок/мл среды. Культивирование проводят при 37 С в течение о

48-60 ч при периодическом вст1;яхивании. Среду освобождают от лич»нок трихинелл центрифугированием при

3000-3500 об/мин в течение 10 мин или фильтрованием. B упернатанте или фильтрате среды определяют содержание белка по методу Лоури, разводят раствором Хенкса до концентратрпс белка 100,0 20,0 мкг/мл и используют для иммобиличапип на фармолинизированных и танизированных эритроцитах барана по общепринятой методике.

Пример 2. Жизнеспособные фракции личинок трихинелл культивирун>т в безбелковой питательной среде по примеру 1, но изменяют количество инсулина.

В табл. 1 показана зависимость накопления культурального антигена от дозы инсулина.

Пример 3. Специфичность культурального антигена определяют в реакции непрямой гемагглютинации

3260 путем сопс>стлвлс >с»я данных РНГЛ с культуральным и коммерческим антигенами, полученных при исследовании сывс>роток крови больньсх ра ч>тичньсми па5 ра зита р ными боле з ня ми (опис торхоз, аскаридоз, дифиллоботриоз, анкилостомидозы, тениаринхоэ, знтеробиоз,лямблис>з) . Результаты этих исследований представлены в табл. 2.

Таким образом, использование пред. ложенного способа позволяет повысить выход трихинеллезного культуральногс антигена в 20-80 раз на единицу био массы трихинелл (25-45 мкг на 10 личинок) и увеличить специфичность серологической диагностики трихи20

Формула изобретения

Спос об получения культурального антигена из Trichinella spiralis, включающий выделение мышечных личинок, их очистку и культивирование в безбелковой питательной среде с послсдуюн1>см отделением целевого продукта,отличающийся тем, что, с целью повышения выхода анти> ена и его специфичности, очистку личинок проводят дифференциальным центрифугированием в 30-607-ном градиенте плотности глицерина, а в питательную среду дополнительно вносят инсулин в дозе 0,02-0,03 Ед/мл.

Та бли ца 1