Способ проведения микрохирургических операций на изолированных яйцеклетках

 

Изобретение относится к биотехнологии , медицине и сельскому хозяйству и может, быть использовано при щ)Оведении микрохирургических операций на изолированных клетках. Целью изобретения является повьшение ав томатизации способа. Способ позволяет полностью автоматизировать основные микрооперации с изолированными клетками, такие как внутриклеточная микроинъекдия, разрезание яйцеклетки к др. , и сшгзить травмирование -клеток путем поочередного закрепления клеток 2 на неподвижном микроприсосе 4. Контроль выхода одиночной клетки 2 р область всасываття -1икроприсоса из питателя 1 и контроль всасывания клетки.2 в накопитель 3 при отводе ее из зоны операции после воздействия на нее микроинструментом 8 и открепления от микроприсоса 4 осуществляют кондуктометрическим методом , не требувлдим освещения клетки, фиксируя.импульс напряжения при прохождении клетки через микроотверстия питателя I и накопителя 3, а угсрав- .ление микроинструментом 8 проводят относительно строго заданного положения закрепленной на неподвижном микроприсосе клетки 2. 2 ял. й

СО103 СОВЕТСНИК

СОЦИАЛИОТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (51) 5 "С 12 Ы 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОЧМРЦТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (46) 23.! 2.90. Бкл. У 47 (21) 4239160/31-13 (22) 28. 04, 87 (71) Специальное конструкторское бюро биологического приборостроения

АИ СССР (72) В.А. Бондарев (53) 578,085, 23(088. 8) (56) S,Ogawa, Н.Takahashi, Personal

coayuter - controlled microsurgery

of fertilized eggs and carly embryos. Theriogenology v. 25, 11 2, 1986, р. 335-345. (54) СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ МИКРОХИРУРГИЧЕСКИХ ОПЕРАЦИЙ НА ИЗОЛИРОВАННЫХ

ЯЙЦЕ КЛЕТКАХ (57) Изобретение относится к биотехнологии, медицине и сельскому хозяйству и может. быть использовано при проведении микрохирургических операций на изолированных клетках. Целью изобретения является повышение автоматизации способа. Способ позволя1

Изобретение относится к биотехнологии, медицине и сельскому хозяйству и может быть использовано при проведении микроопераций на клетках.

Целью изобретения является повыаение автоматизации способа.

На фиг. 1 показан питателв; на фиг. 2 - кривая импульса напряжения.

Способ осуществляется следукщим образом. .Заполняют питатель 1 (фиг. 1), выполненный в виде конической микропипетки, суспенэией клеток 2 в элек..ÄSUÄÄ 1473352 ет полностью автоматизировать основные микрооперации с изолированными клетками, такие как внутриклеточная микроннъекция, разрезание яйцеклеткч к др., н снизить травмирование клеток путем поочередного закрепления клеток 2 на неподвижном микраприсосе 4. Контроль выхода одиночной клетки 2 =- область всасывания . икроприсоса из питателя 1 и контроль всасывания клетки. 2 в накопитель 3 при отводе ее иэ зоны операции после воз" действия на нее микроянструментом 8 и открепления от микропрнсоса 4 осу-ществляют кондуктометрическим мето" дом, не требукп1им освещения клетки„ фиксируя, импульс напрчжения при про хождении клетки через микроотверстия питателя 1 и накопителя 3, а уг;равление микроинструментом 8 проводят относительно строго заданного полокения з акрепленной на неподвюкном микроприсосе клетки 2. 2 ил. тролите (например, в физиологическом растворе, содержащем ионы растворенных в воде компонентов), далее заполняют электролитом накопитель 3, выполненньУг также в виде конической микропипетки. Помещают кончики питателя 1, накопителя 3 и микроприсоса

4 в тот же электролит таким образом, чтобы область I всасывания мнкроприсоса 4 и область IT. всасывания накопителя 3 перекрывались, Через измерительное сопротивление 5 лрикладаваагг к электроду 6 питателя 1 и элекз 147335 троду 7 постоянное электрическое напряжение и одновременно через питатель I создают гидравлический проток, вытесняющий из питателя клетки в область I всасывания микроприсоса

4. При этом при прохождении единич- ной клетки 2 через, выходное микроотверстие питателя 1 увеличивается сопротивление между электродами 6 и 7, j0 ток уменьшается и с сопротивления 5 снимается импульс напряжения U (фиг. 2), амплитуда. которого пропорциональна объему V„„клетки 2. Home окончания импульса останавливают гид- 15 равлический проток и снимают электрическое напряжение через питатель, обеспечивая выход из него только одной клетки 2 (положение "а" клетки

2, фиг. 1.).

Амплитуду импульса U> питателя при условии, что объемная доля р клеток намного меньше 1, т.е. р (< I и удельное сопротивление р« мембрны клеток намного больше -удельного 25 сопротивления рз„ электролита, т.е.

p„„>v p „„,,определяют по формуле

16I ов Ръ 7 « f

U ф» (1) пм;;аде инт "Ит 30 где I Ä - ток питателя при отсутствии в его выходном отверстии клето к, P a — удельное сопротивление электролит а; 35 у, - объем клетки 2 до проведения над ней микроопераМии, - фактор формы и ориентации клеток;

d. диаметр выходного отверстия питателя;

- отношение сопротивления пи» тателя к эвивалентному сопротивлению нагрузки..

Далее создают через неподвижный микроприсос 4 гидравлический проток, присасывающий клетку 2 к его кончи- ку (положение "б" клетки 2) и производят воздействие над ней иикроин струментом.8. После выполнения мани- 5 пуляций микроинструментом 8 создают через микроприсос 4 обратный гидрав лический проток, освобождая клетку и помещая ее s область TI всасывания накопителя 3 (положение ."в", клетки 2); Через измерительное сопротивление 9 прикладывают к электро ду 19 накопителя 3 и электроду 7 по" стоянное электрическое напряжение ч

4 создают через накопитель 3 гидравлический проток, всасывающий через его входное отверстие внутрь клетку 2, Снимают при этом:с сопротивления 9 импульс напряжения Б„ „, амплитуда которого равна

1 6 Тон Рзл Ч кл

U нс к Да (1 Р ) э .. ток накопителя 3 при отсутствии в его входном отверстии клетки 2; объем клетки 2 после прове" дения над ней микроонерации:, диаметр входного отверстия накопителя, отношение сопротивления накопителя к эквивалентному сопротивлению нагрузки, где Х оц

НОК

МОК

После окончания импульса Uù„(ïoложение "г" клетки 2) останавливают гидравлический проток через накопитель 3 н снимают электрическое на" пряжение. Далее повторением всех манипуляций производят .проведение мик- рохирургическкк операций над всеми клетками 2 питателя 1.!

Пример. Требуется провести автоматическую операцию внутриклеточ- ° ной микроинъекции в клетки диаметром

Й„„ =75 мкм, объемом V« 2,2 10 мкм (2,2.10 смэ), помещенных в физраст" воре с удельным сопротивлением р „р

=70 Ом см при й=20 C. Ток питателя и накопителя Х Ia„=100 МкА, диаметр выходного отверстия питателя й„„, =l20 мкм, диаметр входного отверстия накопителя d 120. мкм, фактор формы и ориентации для сферических клеток

f I,5, отношение сопротивления питателя к эквивалентному сопротивлению нагрузки,„„=0,9 и для накопителя

„=0,9, расход раствора при прокачке через питатель и накопитель Ц„,ч.

-"ф, =5 ° 10 мк /с, расход раствора при всасывании и нагнетании через микроприсос Q„ =2,5 -10 мк /с, объем инъецируемой дозы V =10 . мкм

Ф (10 ам ). Время закрепления клетки

На микроприсосе =0,5 с. Время всасы вания кл ет ки в накопитель Йн „

-0,5 е. По формуле (1) определяют амплитуду импульса U снимаемого с измерительного сопротивления питтеля при прохождеи и через его жходное отверстие клетки .

16Хол Рэв%. и

g м - « - := гт

Рнт Т а а (1 + tl )

16 ° 100 10 70 ° 2 2 10 1 5

3, 14 (120 10" ) ° (1+0,9) 14.т 3352 8

11 ВСа<тт. Ваинн НаКОП Д -«!, OПРЕДЕтт;,.Ют з

Ъ|т=Ц а tíà m5 10 аахм /с 0 5 с

=2,5 "10 мкм

Определяют объем области Х всасывания Микро пресо сом при 3 акре. .BIoBvи кпет ки б 9

V;. -"Я„ t 2 „5 I0 мкм /c "0 5

1,25 10 мкм ., б 3

Для упрошення расчетов принимают форму обт1-.:ти I всасываиия микропр— ..Оса сд;Ори«чесмой -, имеющей тиаматp

91 9 катор тй равен т Ъ., 6VI 1 6 1,25 10

Сйедо в ат ель но, --со ичики пит ат ел."; и микроприсоса устанавливают таким образом чтобы Они Тор.. ами: касали ь воображаемой поверхности сферы диаметром 0 =.134 мкм.

Пр икл адыв ают к пит BT елю по стОя и ное электрическос напряжение т=.,ким абраэом4 TO6bI Тоа Iîà питателя бып равен 100 мкА и создают через питa» ель гидравлический проток суспензия клеток с расходом Q„„, 5 10 мкм /с.

После снятия импульса с изьеритель» ного сопротивления питателя, равнога 95 мВ, останавливают гидравли=. ческий прсток "- ерез вр мя tàíò, печиваюп1ее выдавливание из питателя объема электролита (физраствора) вместе с клеткой меньиего ипи равно.го. Ч,. Время 1„„.,между окончанием импульса и окончанием гидравлического ггротока через питатель при этом

ОПРЕДЕЛЯЮТ т. З -yOIIOВИЯ

7 1 25 10 мкм б Э л » тт Х» у. .Ц„„5 ° 10 мкм /с

Создают через неподвижный микроприсос всасывающий проток и присасы-вают к eIO кончику клетку. Дапее вводят в клетку микропипетку с иньецируеиам раствором, вытесняют иэ нее требуемую дозу Ч 10 мкм ., пой 3

"сле чего выводят микропипетку из клетки.. Создают через микроцрисос гидравлический проток в другом направлении,, откр епляющий клетку, и вводят ее э область II всасываиия

-накопителя. П;ти этом объем области -- — -2 „

Принимают форму област -; всасываяия накопителя сферической„ннеяцгй диаметр B ., который равен т

Пт

f

>(47п 6.2 g 10

11 1 т Зт 14 т С аиаВЛИВ еЮ КОНЧИК Ндхалнт рчя т „«BI„y образом,, чтoGbl eno Topen кас::. лся воображаемой поверхности сфеоы диаметром В =-169 мкм„перекрывлсщщ

I область Х в. "взывания микропгисocа, Определяют иь:пульс напрттжения U„ снимаемого с Iизмерительного сопротивления накопит, пя np;I прохождении через его входное отверстие клетки: т О 1 он эа1 ° о f

====.M ==a» > r. о 1+ т а« и

1Ь где V ==(V, + J ) - объем клетки по2.к„( сле ведения в нее инъецируем.т. о раствораа.

16 100 10 С (2 г -10 +10 ). 1,5

3,14 120 10 ) (1+0.„!?) 0 095- 8=95 мБ.

Прикладывают к накопителю постоянное электрическое напряжение таким: образом, чтобы ток I от накопителя был равен 100 мкА и создают через накопитель всасыванию,нй гидравличес" кий проток. После окончания импульса О Ч,,„=95 мН при прохождении клетки внутрь накопителя останавливают гидравлический проток и снимают электрическое напря:ение. Повторением всех манипуляций проводят инъецирование всех клеток питателя, Применение прецложенного способа позволяет обеспечить автоматизацию гикрохирургнческих операций над иэолиров анныжи KJIeTKBüû H сниз1 ть их тр авмиро в ание., Формул а из оор ет ения

Способ про ьедения микрохирурги„ческих операций на изолированных яйцеклетках, включаютуй закрепление клетки на микроприсосе с последующим .проведением операции, о т л и ч аю г; и и с я тем, что, с целью повы1473352

7 щения автоматизации способа, микро- . присос закрепляют неподвижно, подачу и отвод клеток в зону всасывания микроприсоса. и из нее осуществляют поштучно гидранпическим потоком по сред" ством читателя и накопителя через . микроотверстия, причем контроль за поштучным выходом из питателя и flo йтучным входом в накопитель осуществляют кондуктометрическим методом по импульсам напряжения, при этом после регистрации импульса останавливаюг гидравлический поток соответственно через нитатель или накопитель. фиг.2 е

Составитель И.Тареева

Редактор В. Трубченко Техред А. Кравчук

Корректор И. Мак симинские

Заказ 4333 Тираж 483,, . Подписиое

ВяяядК Государственного комитета по иэобретеииям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Рауаккая наб., д. 4/5

Ю Ф Ф ««9 Ю

Производственно-иэдательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101