Способ получения фракции на, содержащей защитный антиген воrdетеllа реrтussis
Изобретение относится к медицинской промьйшенности и может быть использовано при получении коклюшной вакцины. Цель изобретения - интенсификация способа. Для получения -- фракции НА Bordetella pertu ssis культуру в одной фазе выращивают в .жидкой питательной среде известного состава , в которую дополнительно вводят метилированный или /з-циклодекстрин в концентрации 1-10 г/л. При необходимости для стимуляции роста в среду вводят 0,1-20 г/л казаминокислот, 0,01-1 г/л аскорбиновой кислоты и 0,1-5 г/л глютатиона. Процесс культивирования ведут при 20-31°С в условиях аэрации и перемешивания, обеспечивающих концентрацию кислорода 1,0-5,5 ррт и пеногашение. Отбор культуральной жидкости для выделения целевого продукта осуществляют на стадии от -логарифмической фазы роста до статической, 4 табл. О)
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ
К IlATEHTY
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР пО делАм изоБРетений и ОтнРытий (2 i ) 3728854/28-13 (22) 29.03.84 (31) 54680/83 (32) 30.03.83 (33) JP (46) 23.12.88. Бюл. 9 47 (71) Джуридикал фаундейшн дзе Кемосеро-терапевтик рисерч институт и Тейдзин Ль мнтед (ЗР) (72) Акихиро Гиннага, Хироси Коба, Син Сакума, Хисаси Китагава, Акира
Ямада и Едзи Сузуки (Л ) (53) 576.8.097 (088.8) (56) Патент СССР В 1384206, кл. С 12 N 1/20 // (С 12 Н 1/20, С 12 В 1/01) . 15 ° 10 82 ° (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРАКЦИИ НА
СОДЕРЖАЩЕЙ ЗАЩИТНЬЙ АНТИГЕН BORDETELLA PERTUSSIS (57) Изобретение относится к медицинской промышленности и может быть
„„SU„„3447266 АЗ (51)4 А 61 К 39/1 использовано при получении коклюшной вакцины. Цель изобретения — интенсификация способа. Для получения фракции НА Bordetella pertussis культуру в одной фазе выращивают в жидкой питательной среде известного состава, в которую дополнительно вводят метилированный 4- или р-циклодекстрин в концентрации 1-10 г/л. При необходимости для стимуляции роста в среду вводят 0 1-20 г/л казаминокислот, 0 01-1 г/л аскорбиновой кислоты и
0 1-5 г/л глютатиона. Процесс культивирования ведут при 20-37 С в условиях аэрации и перемешивания, обеспечивающих концентрацию кислорода
i,0-5,5 ppm и пеногашение. Отбор культуральной щдкости для выделения целевого продукта осуществляют на стадии от -логарифмической фазы роста до статической, 4 табл.
1447266
Изобретение относится к медицинской промьппленности и может быть использовано при получении коклюшной вакцины, 5
Цель изобретения — интенсификация способа.
Пример 1. В ферментер объемом 50 л загружают 35 л модифицированной питательной среды, 1О содержащей глутамат натрия
10,72 г/л, 1-пролин 0,240 г/л, фосфат калия 0,5 г/л, хлорид калия
0,2 г/л, хлорид магния О, 1 г/л, хлорид. кальция 0,02 г/л, трисгидро- 15 ксиметиламинометан 6,1 г/л, казаминокислоты 10,0 г/л, рН 7,3 (основная среда). Стерилизуют при 121 С
6 в течение 30 мин.
Отдельно готовят дополнительную жидкость, содержащую 1-цистеин гидрохлорид 0,04 г/л, сульфат железа
0,01 г/л, аскорбиновую кислоту /
0,4 г/л, ниацин 0,004 г/л, глютатион (восстановленный тип) 0,15 г/л., Эту среду стерилизуют с помощью мембранной фильтрации. Основную и дополнительную среды смешивают перед использованием. Стерильный метилированный р-циклодекстрин добавляют в конечной концентрации 1,0 г/л.
После инокулирования B,pertussis
1 фазы в количестве 1 10 микр.тел среду культивируют при аэрации через дно реактора с помощью барботера с механичсским обеспечиванием при
35 С, рН 7,2, в течение 24 ч при различном количестве растворенного кислорода (ДО) °
IIoBbIIIleHHbIH рост микроорганизмов и интенсивное продуцирование фракции НА наблюдается в диапазоне до
0,7-6,0 ppIII особенно при 1,0-5,5 ррш.
К культуральной жидкости или к жидкой фазе культуральной жидкости добавляют сульфат аммония до степени
1/3 насьпцения. Осадок отделяют центрифугированием или фильтрованием.
Осадок растворяют в фосфатном буфере (рН 7,2), содержащем f моль NaC1. К
50 раствору добавляют сульфат аммония до степени 1/2 насьпцения, осадок отделяют центрифугированием или фильтрованием, диализуют против фосфатного буфера. Полученный раствор ультрацентрифугируют, верхний слой жидкости центрифугируют в градиенте плотности сахарозы и отделяют верхний слой жидкости (фракции HA В,pertussis). Выделение осуществляют предпочтительно при 4 С и ниже. Полуо ченная фракция НА содержит большое количество LPF-HA u F-HA.
Фракцию HA разбавляют солевьпч раствором до 2-3-кратного разбавления и добавляют формалин в концентрации от 0,1 до 1,2 об,7, Смесь обрабатывают при 20-43 С в течение 3-60 дней..
LPF активность и активность HSF (гистамин-чувствительный фактор) уменьшаются и получают нетоксичную фракциюе
В сравнительных примерах 1-10 и примерах 2-5 проводят сравнение по.лучения фракции НА В.pertussis в различных условиях культивирования (при постоянной аэрации и скорости перемешивания и при переменной аэрации и перемешивании).
В ферментер емкостью 14 л загружс— ют 10 л среды (по примеру 1) и BHG кулируют культуру в количестве
1 10 микр.тел/мл. Культивируют при аэрации и перемешивании при 35 С в течение 36 ч.
Влияние условий аэрации и перемешивания на интенсивность роста культуры В.pertussis 1 фазы и выход целевого продукта представлены в табл.1.
В сравнительных примерах 1-5 7 и 8 культивирование осуществляют при постоянных аэрации и перемешивании беэ пеногашения и в этом ряду примеров условия культивирования в сравнительном примере 5 (скорость перемешивания 100 об/мнн, аэрация—
0,5 УУМ) приводят к хорошему продуцированию фракции НА. Однако скорость роста быстро уменьшается и после
36 ч культивирования концентрация клеток не превышает 15 -!Оз микр.тел/мл.
В сравнительных примерах 7 и 8 культивирование. осуществляют при постоянной скорости перемешивания
500 или 600 об/мин при скорости аэрации 0,2 VVM без пеногашения. После
5-10 ч выращивания клетки либо прилипают к верхней стенке реактора, либо культура выбрасывается из реактора за счет сильного пенообразования, продуцирование HA-фракции низкое °
В сравнительном примере 10 культивирование осуществляют при контро14 лировании ДО, но без пеногашения.
В этом случае также продуцирование
НА-фракции очень низкое из-за адгезии клеток и их выброса с пеной.
В сравнительных примерах 6-9 культивирование осуществляют при постоянной скорости аэрации и перемешивании с пеногашением. Во всех случаях, в которых количество ДО на начальной стадии культивирования больше 6,0 ррш, условия, пригодные для продуцирования фракции НА, не обеспечивались.
С интенсификацией роста культура ДО уменьшается и через 36 ч его уровень снижается до 0,7 ррш, что неблагоприятно влияет на размножение клеток и продуцирование фракции НА.
В сравнительном примере 9, где осуществляют пеногашение с помощью химических веществ, через 36 ч концентрация клеток достигает
80 .10 9 микр.тел/мл, но количества
Г-На и LPF-HA составляет 128 НА/мл и 500 ЬРЕ ед./мл соответственно.
В примерах 2-5 культивирование осуществляют при контролировании ДО в диапазоне 1,6-3,5 ppm с помощью автоматического и непрерывного контроля аэрации и скорости перемешивания ДО-контролером. После 10 ч микроорганизмы росли в логарифмической фазе и после 36 ч получены высокие урожаи клеток Р-НА и LPF-НА.
Осуществление аэрации с поверхности препятствует продуцированию фракции HA.
В сравнительном примере 11 и примерах 6 и 7 проводят сравнительное культивирование по предлагаемому способу и в стандартных статических условиях. Количество инокулята
1 10 микр.тел/мл, температура 35 С.
Статическое культивирование (сравнительный пример 11), Реактор для культивирования 1,5 л, колба КОИХ; среда — модифицированная (пример 1) в количестве 0,2 л, время инкубирования 120 ч.
Культивирование под контролем (примеры 6 и 7 по изобретению). Реактор для культивирования: ферментер емкостью 300 л, среда — модифицированная (пример 1) 200 л, дополнительно содержащая 1 г/л метилированного 1-циклодекстрина (пример 6) и 1,0 г/л метилированного р-циклодекстрина (пример 7). ДО-контроль 2,2-2,4 ppm.
Пеногашение механическое с помощью
47266
4 вращающегося диска. рН-контроль: рН 7,3, время инкубирования 35 ч.
Сравнительные данные по культиви5 рованию в различных условиях приведены в табл.2i
Из табл.2 следует, что способ по.изобретению в 2-3 раза эффективнее статического культивирования по концентрации клеток, в 10 и более
pas — по уровню 3 PF-HA, время инкубации сокращается до 35 ч.
Пример 8. Фракцию НА, полученную в примере 1, разбавляют
15 физиологическим раствором до уровня концентрации протеина 30 мкг
TCAPN/ìë. К раствору добавляют формалин в концентрации 0,6 или
i,0 об.7. и смесь обрабатывают при 37 о
20 или 39 С в течение 5-21 дня, на стадии обработки формалином добавляют аминокислоты (глицин, лизин, серии, метионин, цистеин, глютамат натрия или аспарагиновая кислота в концентрации 0,25 М или смесь глицирина и серина в концентрации 0,15 М).
В течение обработки формалином аггрегируется осадок, а раствор диализуют для удаления формалина. Цео0 левой продукт контролируют на остаточную токсичность на мышах, а. после трехнедельного хранения при 37 С"на обратимую токсичность.
Пример 9. Штамм Tohama фазы 1 В ° pertussis культивируют В сре де Bordet-gen-gengon, получают посевную культуру и используют ее для инокулирования 0,4 л модифицированной среды (пример 1),, которая до40 полнительно содержит 10 мг/мл метилированного 4-циклодекстрина, в двухлитровой колбе при конечной концентрации 10 микр.тел/мл.
Инкубацию осуществляют при вра4В щательном встряхивании при 200 об/мин и при 35 С в течение 18 ч для получения посевной культуры.
Полученные культуры объединяют и инокулируют в такую же среду, как
50 было описано, в ферментер емкостью
300 л в количестве 1.10 9микр.тел/мл; культивируют в условиях аэрации и перемешивания.
Культивирование осуществляют
55 при автоматическом контроле аэрации и скорости перемешивания, поддерживая ДО в диапазоне 1,8-2,7 ррш. Температуру поддерживают на уровне
35 С, рН 7,2. Пеногашение осуществ5 1447266 6 лякп механически с помощью ротацион- 0,2 мг/мл (в расчете на алюминий), ного диска. при зтом HA-фракция адсорбируется
Через 35 ч культивирования отби- на геле, к которому добавляют рают пробу культуральной жидкости и 5 0,01 вес./об.X тимерсола. Получают измеряют концентрацию клеток очищенную убитую адсорбированную (210 10 микр.тел/мл), F-HA коклюшную вакцину. (1024 HA/Më) и 1.РГ-НА (2400 LPE ед/мл} Результаты проверки вакцины пред-.
Культуральную жидкость центрифугиру- ставлены в табл.3. ют и отделяют супернатант. К нему 10 П р и .м е р 10, К разбавленному добавляют сульфат аммония до степени раствору нетоксичной фракции HA насыщения 1/3, образующийся осадок (пример 9) добавляют дифтерийный токотделяют центрифугированием при соид (33 Lf/èë) и сто;;лнячный Y(2K10000 об/мин в течение 30 мин. Осадо: соид (5 Lf/ìJt}, к смеси добавляют растворяют в буферном растворе 15 гель гидроокиси алюминия (0,2 мг/мл (РН 7,2}, содержащем дополнительно в расчете на алюминий) для получения
1 моль NaC1, и отделяют нерастворен- адсорбированной тривакцины. К смеси ные вещества центрифугированием при добавляют 0,02 вес./об. . желатины и
10000 o6/мин в течение 30 мин. К по- О> 1 вес./об. глюкозы для стабипизалученному верхнему слою жидкости до- 20 ции препарата, а также 0,01 вес./об.X бавляют сульфат аммония до степени тимерсала в качестве фиксатора. насыщения 1/2. Получающиеся осадки Свойства полученной тривакцины отделяют центрифугированием по опи- представлены в табл.4. санной методике и повторно растьоряют в буферном растворе, диализуют
Таким образом, использование предпри 4 С и нерастворенные вещес"t3a лагаемого способа позволяет интенсиотделяют центрифугированпем и отбра- фицировать процесс получения коклюшсывают. Раствор усиленно центрифуного антигена, используемого для гируют Упернатант Це тр ФУг Руют приготовления моно- и тривакцины в градиенте плотности сахарозы (АКДС-вакцины).
10-30 (39000 об/мин в те-тение
?О мин) и затем отделяют фРакции НА, ф о р м у л а и з о б р е - е н и я
Полученные фракции НА обьединяют и стерилизуют фильтрованием через мем- Способ получения фракции НА,, собРанный фильтР. Раствор, содержащий 35 держащей защитный антиген 8ог1еГе11а
НА-фракцию, Разбавляют бУфеРным раст- регГпзз1з, включающий культивировавоРом до концентрации пРотеина ние штамма Ногс1е1е11а рег изз1з в
300 мкг ТСАР/мл. Все стадии обработ- 1 фазе в жидкой среде в присутствии ки культуральной жидкости и очистки 1-10 г/л метилированного а-öèêëoцелевого продукта осуществляют при 40 декстрина или метилированного р --цик2-4 С. лодекстрина и при необходимости O,iК полученной НА фракции добавля- 20 г/л казаминокислот, 0,01-1 г/л аскорбиновой кислоты и 0,1-5 г/л
-80 О 02 вес./об, желатины и глютатиона в.условиях перемешивания твина-,, вес. о
45 о л ченной НА
0,25 M глицина и хранят смесь в те- . при 20-37 С и отбор полученнои чение 7 дней при, месь по л
7 " 39 С С е после фракции из культуральной среды на
Ф сфатного стадии от логарифмической фазы роста хранения диализуют против îñ.àòÿîго б ф уфера р Н 7 2 дополнительно содер- до статической фазы роста, о т л ижащего 0,7 вес./об.X NaC1, и полу- ч а ю шийся тем, что, с целью бу- 5О интенсификации способа, культивироченный раствор разбавляют тем же увание и оводят в присутствии раствсренного кислорода в количестве 1,05 5 m в условиях, обеспечивающих нетоксичной НА-фракции добавляют гель, РР исключение пенообразование. гидроокиси алюминия в количестве
1447266
Таблица 1 .!
Условия
Пример
Аэрация
VV9
ПеремешиКонтроль
DO, ppm +
Полученное количество после 36 ч култивироОбеспекультивировани вание, об/мин ниваф Ф ние вания
1 !
HA/мл LPE ед/мл
1О микр. тел/мл
Сравнительный
0,05 50
0,10 100
0,50 50
0 50 300
0,50 100
0,50 100
0,20 500
0,20 600
0,20 600
О
8 4 О
1 4 О 15 16 100
Постоян- 5 ные аэрация и пе- 6
30 128 90 ремешивание 7
16 50
10 4 О
80 128 500
30 16 50
Авт +(2,5-3,5) Авт ++
Предлагаемый
Авт 100 +(2„4-2,8) 120 512 1100
100 512 1000
120 512 1100
120 1024 1300
Непрерывное ва0 50 Авт +(1,6-3 2) рьирование аэрации и пе+(2,3-2,.6) Авт Авт
Авт Авт +(1,7-1,9) ремешивания
При контролировании (+), без контролирования (-).
С химическим обеспениваюшим агентом (+), механическое обеспенивание (-).
"Авт" означает, что аэрацию и перемешивание изменяют автоматически для контроля DO.
СтатичесПоказатели культивирования кое культивирование (прототип) Сравнительный пример 11
Пример 7
Да
Концентрация клеток (10 микр.тел/мл) 85
210
210
Количество
F-НА, НА/мл
1024
1024
1024
1з0
2350
Таблица Э
Характеристика коклюшной вакцины
Результат
Содержание азота протеина, мкг/мл 8
Тест яа стерильность
Тест на устойчивость
Концентрация ионов водорода
Тест на независимость от термолабильного токсина
Прошел
Тест на токсичность (по уменьшению живого веса мьппи), ВМ3 ед/мл
Добавление метилированного e(или р-циклодекстрина
Количество
Ы PE-HA .Н РЕ ед/мл
Время до фазы стационарного роста, ч 0
Таблица 2
Интенсивное культивирование в ферментере (по изобретению) Пример 6
Стерильно
Прошел
Прошел
7,2(2,914,0) 1447266
Продолжение табл. 3
Тест на токсичность (по возрастанию лейкоцитов мыши), LP ед/мл
Тест на токсичность (по чувствительности к гистамину мыши), HS ед/мл
Пирогенный тест (общая температура 2 С) Прошел, 0,4
Содержание алюминия, мкг/мл
Содержание тимерсала, вес./об.X
О, 168
0,009
Содержание формальдегида, вес ° /об.X
0,002
Тест на независимость от аномальной токсичности;.
Прошел на мыши на гвинейской свинье
Тест на эффективность, Прошел, 1Р ед/мл 13,5
Т а блица 4
Характеристика тривак- Результат цины
Содержание азота протеина, мкг/мл
28,0
Стерильно
Тест на стерильность
Прошел
Тест на устойчивость
6,72
Тест на независимость от термолабильного токсина
Прошел
Прошел
9,3
Тест на токсичность (по уменьшению
Концентрация ионов водорода
Прошел
0,82 (0,42-1, 25)
Прошел
0,06 (0,01-0, 16) 1447266 14
Продолжение табл.4 (4,2-17,0) Прошел, 0,5
0,174
Ов0094
Ов002 токсичности:
Прошел на мьппи на кролике коклюшная вакцина
Прошел, 13,4 дифтерийный токсоид
Прошел, 48,4 столбнячный токсоид
Прошел, 44,2 живого веса мьппи), BWD ед/мл
Тест на токсичность (по увеличению лейкоцитов мьппи), LP ед/мл
Тест на токси чность (ло чувствительности к гистамину мьппи)„
HS ед/мл
Пирогенный тест (общая температура
2ьс) Содержание алюминия, мкг/мл
Содержание тимер= сала, вес./об.7
Содержание формальдегида,,вес./об.Ж
Тест на независимость от аномальной на гвинейской свинье
Тест на стерильность: на гвинейской свинье
Тест на эффективность. ед/мл:
Прошел
0,66 (0,33-1,02) Прошел
0,04 (О, 01-0, 12)