Способ определения ростовой характеристики питательных сред для клеточных культур
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для оценки ростовых свойств питательных сред, а также для оценки токсичности их компонентов и различных добавок к питательным средам. Целью изобретения является упрощение способа . Способ заключается в том, что в исследуемой питательной среде измеряют содержание карбонильных соединений , выращивают на этой среде клетки ВНК-21 в качестве тесткультуры в течение 2-4 дней, подсчитывают их количество, определяют индекс пролиферации первого пассажа и измеряют уровень карбонильных соединений в надклеточной жидкости. Затем по выведенному уравнению для клеток ВНК- 21 находят ожидаемое среднее значение индекса пролиферации по четырем D пассажам: Ш1,.4 14,3-57,3 , где П , величина прироста оптической плотности при длине волны 505 нм, свидетельствующая об изменении концентраций оснований Шиффа, образующихся при взаимодействии апьдегидов (кетонов) с 2,,4-диннтрофенилгидразином, характеризующая уровень карбонильных соединений; ИЩ- индекс пролиферации, соответствующий отношению количества клеток после первого пассажа к посадочной дозе; Ш1,.4- среднее значение индекса пролиферации по четырем пассажам. 1 з.п. ф-лы, 1 табл. с $ ьэ ел сд to
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИО ЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУЬЛИН
ГОСУцАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОЕРЕТЕНИй И ОТНРЫТИй (21) 4073634/28-13 (22) 02.06.86 (46) 23.09,88.. Бюл. 9 35 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии (72) Г.И.Распопина, А.H.Äåöèíà, А.Г.Бачинский и 10.В.Кондрахин (53) 663 ° 15 (088 ° 8) (56) Lim D. А. rapid biochemical
test for measuring chemical toxicity. — Bull.Contam.Toxico1. 1981
v.26, У 2, р. 145-149.
Metcalte S.M. Cell culture as a
test system for toxicity. J.Pharm.
Pharmae. 1971 9 23, р.817-824. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РОСТОВОЙ
ХАРАКТЕРИСТИКИ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ
КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР (57) Изобретение относится к Ъиотехнологии и может быть использовано для оценки ростовых свойств питательных сред, а также для оценки токсичности их компонентов и различных добавок к питательным средам. Целью изобретения является упрощение способа. Способ заключается в том, что в
„„SU„„1425542 А1 (pe y G .01 N 33/48, С 12 N 5/00 исследуемой питательной среде измеряют содержание карбонильных соединений, выращивают на этой среде клетки ВНК-21 в качестве тесткультуры в течение 2 — 4 дней, подсчитывают их количество, определяют индекс пролиферации первого пассажа и измеряют уровень карбонильных соединений в надклеточной жидкости. Затем по выведенному уравнению для клеток ВНК21 находят ожидаемое среднее значение индекса пролиферации по четырем
gSC5 пассажам: ИП, 4 =14,3-57 3— 5 где р -, — величина прироста оптической плотности при длине волны
505 нм, свидетельствующая об изменении концентраций оснований Шиффа, образующихся при взаимодействии альдегидов (кетонов) с 2,4-цинитрофеннлгидразином, характеризующая уровень карбонильных соединений; ИП индекс пролиферации, соответствующий отношению количества клеток после первого пассажа к посадочной дозе; ИП, 4 - среднее значение индекса пролиферации по четырем пассажам.
1 s.ï. ф-лы, 1 табл.
1425542
505 ! где О, величина прироста опт и-. ческой :тлоткости при
ЗО длине волны 5О5 км, свидетельствующая об изменении. концентрации осно" ваний Шиффа, образующих- ся при взаимодействии
/ яльдегидов (кетонов) с
2,4-динитрофенилгидраэином, характеризующая уро-вень карбонильных соеди нении 9
4О индекс пролиферат ии, соответствующии отношению количества клеток после первого пассажа к посадочной дозе; среднее значекие иццекса полиферации по четыИП, ИП, 4 реи пт сажам.
Э
УРЯВНЕКИЕ IIOII eHO КЯ. ОСНОВакИИ статистического анализа регрессионным методом базовых экспериментальных данных (и:= 32):, .включающих измерение величикы АП,,, ИП,„. 3„ т для широкого набора различных по качеству питательных сред.„. приготовленных на основе индивидуальных аминокислот или белковых гидролизатов. о F03
При значениях отношения О /ИП, >0,25 питательные среды имеют ИП,, -.
Изобретение î" íîñèòñÿ к биотехнологии и может быть использовано для оценки ростовых свойств гитательных сред, а также для оценки токсичности их компонентов и различных добавок к питательным средам.
Целью изобретения является упрощение и ускорение способа.
Способ осуществляется следующим, образом.
В исследуемой питятегп-,ной среде
: измеряют содержание карбонильжтх со, единений, выращивают на "-той среде клетки BHK-21 в качестве тест-куль туры в течение 2".4 дней,. подсчиты вают их кбличество, определяют ин=. декс пролиферяции первого пассажа
1, (ИП ) и измеряют уровень карбонильI ных соединенич в надклеточкой жид; .кости, затем по выведенному уравке1, кию для клеток BHK-21 находят ожидя1
I емое среднее значение индекса проли1, ферации по четырем пассажам ИП„,„q
I !
О.;
ИП = (43- 57 3 тф 9 Р И.П I
<3 {для клеток BHK--21) и считаются .токсичными. При значениях этого отношения « 0,25 предлагаемый способ позволяет предскаэывать значения
ИП, q, в интервале от 3 до 13 с доверительным интервалом + 2,б ед. ИП при уровне вероятности 95 7..
Наличие таких зависимостей связано с тем, что клетки при культивировании испытывают комплекс воздействий со стороны окружающей среды (ка" личие ионов переходных металлов, окислителей и т.д.), которые вызывают интенсификацию процесса перекисного окисления липидов, ведущего к накоплению карбонильных соединений типа малонового диальдегида.
В некоторых случаях карбонилькые соединения в определенных концентрациях сами по себе могут оказывать токсическое действие на клеточкъте культуры.
Новыми признаками способа являют-. ся измерение содержания карбонильных соединений в питательной среде до и после выращивания на ней. попу ляции клеток BHK-21 и определение ростовых свойств рассматриваемой питательной среды по приросту карбонильных соединений с использованием статистически отработанного уравнекия
Данная совокупность признаков способа приводит к значительному сокращению времени проведения анализа, упрощению и удешевлению способа получения количественных характерис" тик ростовых свойств питателькых ср ед с
Способ определения ростовых характеристик питательных сред для клеточных культур ВНК-21 позволяет в течение одной рабочей сиены протестировать свыше шести образцов питательных сред. Способ целесообразно применять для оценки ростовых свойств при конструировании новых питательньм сред, пригодности сырья в производстве питательных сред, а также при изучении влияния различных химических веществ ка рост клеточных культур и таким образом зконоьл".ть время, материалы, реактивы и снижать трудозатраты. Ок расширяет арсенал средств для контроля токCNBViOCTH H РОСТОВЫХ СВОйС 25542 4 ние ИП», равное 0 3 что свиде» тельствует о токсичности этой пита5>5 О» 5 тательной среды (— — — (О, 25} . Эта ИП, величина также удовлетворительно согласуется с экспериментальным значением ИП„ p . Приведенные данные подтверждают применимость предлагаемого способа для определения ростовых характеристик питательных сред. 14 Пример. Измеряют содержание карбонильных соединений в анализируемой питательной среде по их реакции с 2,4-динитрофенилгидразином. Для этого в пробирку, содержащую 0,6 мл анализируемой среды, добавляют 0,5 мл 0,27.-ного раствсфа 2,4.динитрофенилгидразина в 1 н раствора соляной кислоты, затем 2 мл 0,4 н. Na0H. Пробу вьдерживают оба раза при комнатной температуре в течение 10-15 мин и измеряют оптическую плотность поглощения раствора при длине волны 505 нм с помощью спетрофотометра СФ-16 в кювете (1 = 1 см). Далее выращивают клетки ВНК-21 на анализируемой среде. Для этого клетки, вьдерживаемые на контроль йой питательной среде, разводят в стерильных условиях до оптимальной посевной концентрации анализируемой питательной средой и рассеивают в два (или 3-4) культуральных сосуда с посадочной дозой 100 тыс.кл/мл, закрывают пробками и маркируют. Культуральные сосуды инкубируют в термостате при 37 С; через три дня надклеточную жидкость сливают для оценки уровня карбонильных соединений с.помощью 2,4-динитрофенилгидразина и подсчитывают клетки, предварительно переводя их в суспензию, с помощью камеры Горяева (нестерильно), определяя таким образом величину ИП . При оценке уровня карбонильных соединений и подсчете количества клеток используют оба культуральных сосуда для определения средних арифметических указанных величин. Прогнозируемое среднее значение индекса пролиферации по четырем пассажам (ИП, д ) вычисляют по формуле. Результаты таких расчетов для Опытных cpep (ИП»,,»» дц ». ) В сопос тавлении с экспериментальными данными (ИП»- а э»,спериме»,т ) по известному способу приведены в таблице. Из приведенных в таблице данных следует, что расчетные и экспериментальные величины ИП »,„ для питальных сред 2-6 находятся в удовлетворительном согласии и свидетельствуют о высоких ростовых свойствах. Для образца 1 получено расчетное значеФормула изобретения 1. Способ определения ростовой характеристики питательных сред для клеточных культур, предусматривающий выращивание тест-культуры на испытуемой среде и определение среднего значения индекса пролиферации по первым четырем пассажам с последующей оценкой полученных результатов, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, среднее значение индекса пролиферации по первым четырем пассажам определяют путем измерения о содержания карбонильных соединений З0 в питательной среде до и после культивирования тест-культуры в течение первого пассажа и по приросту их концентрации в расчете на одну клетку, а оценку полученных результатов производят по формуле: ИП = 14 3 — 57 3 — — »-4 э ИП » 5O$ где О, — величина прироста оптической плотности при длине волны 505 нм, характеризующая уровень карбонильных соединений; ИП, — индекс пролиферации, 45 соответствующий отношению количества клеток после первого пассажа к посадочной дозе; ИП, — среднее значение индек50 са пролиферации по четырем пассажам. 2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве тесткультуры используют штамм культивируемых клеток животных ВНК-21. 1425542 Индекс пролиферации клеток ВНК-21 Средние величины индексов пролиферации клеток BHK-21 по четнрем пассажаи Аналнеируеиая среда Оптичес оре плотности прост онечисходная, 0 Ррг р рср ННi-s рарчет D.эт (по предложенному способу) I НИр-а рр вар а2ег (no нэвестноиу способу) после первого пассажа, ИП, ая 0,3 g 2,6 12р1 + 2рб 12,2 х 2 ° 6 f,6й 2,7 1Зр3 + 2,1 12р2 х 0,9 Ор23 1р33 1р3 0,24 О, 7G Ор32 Ор23 0,77 Ор82 ЛСЯ 40Р ЙСС (ВНК" 21) с9 13,7 ЙСС(ВНК-2! ) с9 аргинин отеч. рроиэводства I!CC(BHK-2I)c8 13;9 0,24 1,40 1,16 0 22 0 13 0 9 I 8р0 + 2рб 9р3 + 2,6 10,3 10р! и Ь>4 11,7 i 9,9 12,4 и 6,3 11СЯ 44Р «СЯ 45Р 10р9 10,8 0,23 1,11 0,88 9рб + 2рб Составитель Л,Минеева Корректор С.Черни Редактор Г.Волкова Заказ 4761/40 Тираж 847 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР но делам изобретений и открытий l13035 Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Приведенные в таблице нитатель1!ые среды не входят в число базовых, 20 фоторые были использованы для определения коэффициентов уравнения. Среда. ПСС (ВНК-21) содержит, мг/л: NaC1 5800, КС1 360; ИаНЯРО)» Я2НЯО 140; СаС1 90; MQS04 7Но0 1801 25 глюкоза 4500; феноловый красный 7э 1-аргинин НС1 127,6; 1-цистин 32; 1-глутамин 584; 1-гистидин НС1 11,; -изолейцин 25; 1-лейцин 33; 1-лизин 0; 1-метионин 38; 1-фениланин 15; 1-треонин 46; 1-триптофан 15 1-тирозин 32; 1-валин 50; 1-серии 56; 2 ОЛИНХЛОРИД 3; фОЛИЕВаЯ КИСЛОта Зэ 6)езоинозит 6; никотинамид 3, пантотенат кальция 3; пиридоксаль гидроМлорид 3, тиамингидрохлорид 3; рибофлавин 0,3; ЯаНСО 2500; сыворотка Крупного рогатого скота 100 мл/л. Для приготовления этих питательных сред используют аминокислоты 40 фирмы "Сигма" (СНА), остальные реактивы отечественного производотва квалификации ч. и х.ч, В одном случае к среде ПСС(ВНК-21) добавляют дополнительно 127,6 мг/л 1 -аргинин 45 гидрохлорида. В средах ПСЯ 40Р ПСЯ 44Р и ПСЯ 45Р вместо 1-гистидина, 1-изолейцина, 1-лейцина, 1-лизина, 1-метионина, 1-фенилаланина, 1-треонина, 1 тйрозина, 1-валина и 1-серина добавляют 2220 мг/л ферментативного гидролизата протеинов "миражного" яйца (отходы птицеводства), полученного в разных условиях (4ОР-длительность гидролиза 4 ч, без очистки; 44Р— длительность гидролиза 5 ч, без очистки; 45Р— длительность гидролиза 5 ч, очистка с активированным углем марки ОУЛ). Доверительный интервал Х при уровне вероятности 95 Ж получен в результате статистического анализа отклонения базовых экспериментальных данных (n = 32) от их значений, вычисленных.по формуле. Доверительный интервал 1 9 при уровне вероятности 95 4 получен в результате статистического анализа вариаций при экспериментальном определении ИП! 4, при этом используют усредненное значение величины квадратичного отклонения для четырех пассажей.