Способ получения челночного вектора

 

Изобретение относится к биотехнологии , к генетической инженерии, и касается челночного вектора, который содержит фрагмент ДНК и фрагмент ДНК Escherichia coli и может воспроизводиться как в E.coli, так и в дрожжах. Цель изобретения - создание высококопийного вектора. Для этого фрагмент Есо RI размером 8 кв, содержащий полипептидный РбО ген, молекулярной массой 60000 дальтон вводится в точку Есо RI плазмиды pBR 322 E.coli, в результате чего образуется плазмида, которая служит в качестве исходного продукта для дальнейшего конструирования вектора рАТ 77. о

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)4 С 12 N 15/00

j г с

APg

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3635251/28-13 (22) 19.08.83 (31) 145093/82 (32) 20.08,82 (33) JP (46) 30.04.88. Бюл. Ф 16 (71) Джуридикал Фаундейшн Дзе КемоСеро-Терапевтик Рисерч Институт (JP) (72) Ацуси Миянохара, Акис Тох-Е и Кениси Мацубара (JP) (53) 575.224.2;577.2 (048) (088,8) (56) РаЫо Valenruela et.àl.Synthesis

and assembly of hepatitis В. virus

surface antigen particles in yeast. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕЛНОЧНОГО ВЕКТОРА,„Я0 ÄÄ 1393317 А 5 (57) Изобретение относится к биотехнологии, к генетической инженерии, и касается челночного вектора, который содержит фрагмент ДНК и фрагмент ДНК

Escherichia coli и может воспроизводиться как в Е.coli, так и в дрожжах.

Цель изобретения — создание высококопийного вектора. Для этого фрагмент

Есо RI размером 8 кв, содержащий полипептидный Р60 ген, молекулярной массой 60000 дальтон вводится в точку

Есо RI плазмиды рВР. 322 E.coli, в результате чего образуется плазмида, которая служит в качестве исходного продукта для дальнейшего конструирол вания вектора рАТ 77.

1393317

Изобретение относится к биотехнолОгии, а именно к генетической инженерии, и касается челночного вектора, который содержит дрожжевой фрагмент

ДНК и фрагмент ДНК Escherichia coli промотор кислой фосфатазы и может воспроизводиться как в Е.coli, так и в дрожжах.

Целью изобретения является создание высококопийного вектора.

Для этого фрагмент Есо НГ размером

8 кв, содержащий полипептидный Р60 ген, молекулярной массой 60 000 дальтон вводится в точку Есо RI плазмиды 15

pBR 322 Е.coli, в результате чего образуется плазмида, .которая служит в качестве исходного продукта для дальнейшего конструирования вектора .рАТ 77. 20

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Фрагмент co RI размером 8 кв, содержащий полипептидный ген Р60 молекулярной массой 25

60000 дальтон, получают из банка генов 8288 С, клонируют в Есо 1Л сайт плазмиды pBR 322 E.coli.

Эту плазмиду переваривают с эндонуклеазой Sal I и сшивают ДНК-лигазой 30

Т, образуя плазмиду рАТ 25, в которой удален из точки Sal I в фрагмент ген кислой фосфатазы 5,2 кв. Полученная плазмида рАТ 25 состоит из фрагмента плазмиды pBR 322 (примерно 3.,7 кв) от точки Eco RI до точки . Ва1 I который содержит ген стойкости к ампициллину, и фрагмента (примерно

2,8. кв) от точки Есо КХ до точки

Sal I, содержащего дрожжевой. ген кис в 10 лой фосфатазы.

В точку Есо RI указанной плазмиды рАТ 25 вводят фрагмент Есо КХ (1,4 кв), содержащий ген arв 1--trp I, который выделяют из плазмиды YR 7 посредством 45

Есо RI, в результате получают плазмиду рАТ 26. Указанный фрагмент ars Itrp I имеет одну точку распознавания ограничительного фермента Hind III в гене trp I

В точку Hind III указанной плазмиды рАТ 26 вводят Hind III фрагмент, содержащий Leu 2 и 2 pori, который получают путем обработки плазмиды р8ЬЕ I посредством H1nd III эндонук 55 пеазы, в результате .получают челночный вектор рАТ 77. Этот челночный вектор в штамма Saceharomyc.es «erevi—

siae AH 22 был сдан на хранение в Научно-Исследовательский Институт Ферментации,Лгентгтво по промьпиленным исследованиям и технологии, Япония, ВийаревГ Treat у и ему присвоено официальное название "FERN BP-324".

Полученный таким образом рАТ 77 (1 мкг) расщепляют Sal I эндонуклеазой и затем обрабатывают экзонуклеазой

ВАЬ 31 (0,1 U) в растворе (50 мкл)

20 MM Трис — НСI (pH 8,2), 12 мМ, СаС1

12 мМ МрС1, 1? М 11аС1 и 1 мМ ЕДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) в течение от 30 с до 1 мин. Реакционную смесь подвергают экстракции фенолом и осаждению. Полученные осажденные продукты обрабатывают эндонуклеазой Xho Т (Ium) и ДНК-лигазой Т . В течение 12 ч Е.cali х 1776 обрабатывают указанной реакционной смесью таким образом, что происходит трансформация F.coli х 1776 и образуются стойкие к ампициллину трансформанты.

Из колоний трансформантов получают плазмиды ДНК. Определяют нуклеотидную последовательность полученных ДНК, и зону гена кислой фосфатазы, удаляемую при обработке BAL 31. Наряду с указанным ДНК отбирают и выделяют плазмиды рЛМ 81, рАМ 82, pAN 83 и рАМ 84, которые полностью лишены структурного гена фосфатазы.

Обозначая А в кодоне ATG, кодирую щем первую аминокислоту (метиоиин) продукта Р60 структурного гена фосфатазы как +1, отмечают, что в челночных векторах удалены следующиЕ зоны: вектор . рАМ 81 до +2; вектор pAN

82 до -33; вектор рАМ 83 до-.50; и вектор рАМ 84 до-51. Векторы

pAI" 81, pAN 82, рАМ 83 и pAN 84 в

Saccharomyces cerevisiae AH 22/pAN 81, АН 22/pAN 82, АН 22/рАМ 83, и АН 22/

/рАМ 84 соответственно были сданы на хранение в Научно-Исследовательский

Институт Ферментации, Агентство по промышленным исследованиям и технологии, Япония, Budapest Treaty, и им присвоены официальные названия, соответственно "FERII ВР-325", "FERN BP3 13", "FERN ВР-327" и "FERN BP-326".

lI p и м е р 2. Получают кровяную плазму, собранную от десяти. пациентов (в количестве 700 мл), которые имеют положительную реакцию на HBsAg (небольшое отклонение от типа adr) и на

HBeAg, и эту плазму центрифугируют при скорости вращения центрифуги

5000 об/мин в течение 20 мин с целью

1393317 удаления нерастворенных веществ. Полученный раствор центрифугируют при температуре 4 С, при скорости вращения центрифуги 18 000 об/мин в тече5 ние 8 ч, и образующиеся осажденные продукты снова растворяют в 10 мл буферного раствора (pH 7,5) 10 мИ, Трис-НС1, О, 1 М ИаС1 и 1 М ЕДТА.

Этот раствор вводят в верхнюю часть пробирки центрифуги, содержащей ЗОХ сахарозы, и центрифугирование осуществляют при 4 С при скорости вращения центрифуги 39 000 об/мин в течение

4 ч. Полученные осажденные продукты повторно растворяют в таком же буферном растворе, что указан выше.

Для того, чтобы облегчить описан= ную операцию, буферный раствор химически взаимодействует с HBY ДНК полимеразой при обработке его в смеси (500 мкл) 67 мМ. Трис- НС1 (рН 7,5), 80 мМ NH С1, 25 мм MgClg, 0,5 NP40

tt (тергитол, выпускаемый фирмой Сигма 25

Ko"), О, 1Х 2-меркаптоэтанола, 330 мкл

dCTP (дезоксицитидинтрифосфат), dGTP (дезоксигуанозинтрифосфат) и dATP (деоксиаденозинтрифосфат),0,5 мкм

1.32 l dTTP (дезокситимидинтрифос-30 р 3

0 фат) при температуре 37 С в течение

3 ч, и в эту реакционную смесь вводят такой же объем 100 мМ раствора ЕДТА.

В результате одноцепочечная ДНК удваивается до двуцепочечной ДНК, образуя

35 меченый (32> 3 продукт. Этот продукт вводят в пробирку центрифуги (свер- ху), в которой находятся слои 30, 20 и 10Х-ного водных растворов сахарозы в указанном порядке, и осуществляют центрифугирование при температуре

4 С при скорости вращения центрифуги

39 000 об/мин в течение 4,5 ч.

Для разрушения белков, прочно свяванных с ДНК, полученные осажденные продукты обрабатывают в смеси (200 мкл)

1 мг/мл проназы Е (изготавливается фирмой Kakeu Kadaku К.К) и 0,27.-ным водным раствором натрийлаурилсульфата о 50 при температуре 37 С в течение 2 ч.

Полученную смесь дважды экстрагируют фенолом (200 мкл) и образующийся содержащий ДНК экстракт промывают простым эфиром с целью удаления феноль55 ного растворителя, в результате чего получают раствор HBV ДНК. Образующаяся таким путем ДНК имеет удельную радиоактивность 2,5 х 10 отсч. (мин)

1 мкг и может использоваться для вываривания ограничительнымИ ферментами., Двухцепочечную кольцевую HBV ДНК, полученную как описано выше, клонируют с использованием ДНК -фага Шарон

16А в качестве вектора, и затем снова клонируют с использованием известной плазмиды рА СУС 177 в качестве вектора следующим образом.

HBV ДНК (20 нг) обрабатывают эндонуклеазой Xho I в смеси (20 мкл)

10 мИ Трис-НС1 (рН 7,4), 7 мМ MgCla, 100 М NaC1 и 7 мМ 2-меркаптоэтанола при температуре 37 С в течение 2 ч.

Полученную смесь экстрагируют фенолом (20 мкл) и затем простым эфиром и к водному слою добавляют двойной объем охлажденного этанола с целью осаждения ДНК. Смесь выдерживают при температуре -70 С в течение 1 ч и затем . центрифугируют при скорости вращения центрифуги !О 000 об/мин в течение

5 мин и осажденную ДНК извлекают.

Отделенные таким образом осажденные продукты растворяют в смеси (5 мкл)

10 мИ Трис-НС1 (рН 7,4), и 1 мМ ЕДТА

HBV ДНК с равномолярным количеством

ДНК Д -фага Шарон 16 А, полученным путем расщепления эндонуклеазой Xho 1 и с ДНК-лигазой Т (смесь 50 мм ТрисНС1 (рН 7,4), 10 M MgClg, 10 мИ дитиотреитола, 100 мкг/мл альбумина телячей сыворотки, 0,5 мМ АТР и

0,5 мкл ферментного препарата лигазы

Т, полученного фирмой "Такага biomedicals" I — 5x10 ед/мл при температуре 4 С в течение 18 ч. Реакционную смесь экстрагируют фенолом и простым эфиром и затем подвергают осаждению этанолом таким же образом, как описано выше.

Полученные таким образом осажденные продукты растворяют в смеси (10 мкл) 10 мИ Трис-НС1 (рН 7,4) и

1 мМ ЭДТА.

Обработанную таким образом ДНК подвергают операции упаковки с образованием A -фага и затем из него образуют колонии (10«) на чашках (23х х23 см) с L-агаром с использованием

Е.coli gP50 SupF в качестве индикатора. Эти колонии подвергают гибридизации с использованием меченой 32>

HBV ДНК с тем, чтобы отобрать образующиеся колонии из фага, имеющего НВЧ

ДНК, в результате чего отделяют множество желаемых фагов.

1393317

Из фага, включающего HBV ДНК, полученного как указано выше в разделе, приготавляют фаговую ДНК с использованием Е. coli ДР 50 — Sup F в качестве заражаемых бактерий. Полученную таким образом ДНК переваривают Xho I в тех же условиях, что описаны выше, в течение 2 ч, и полученную реакционную смесь подвергают электрофорезу с

0,75Х-ным агарозным гелем, в результате чего извлекают НВЧ ДНК (3,2 кв).

HBV ДНК адсорбируют на ДЕАЕ (диэтиламиноэтилцеллюлоза) бумаге (изготав— ливаемой фирмой Тоуо Roshi, Япония) (° с целью отделения ее от вектора ДНК и затем элюируют 1 М водным раствором, в результате чего получают HBV

ДНК, имеющую с обоих концов группы

Xho Х, 20

Плазмиду рАСУС 177 с единственным сайтом Xho Е в пределах гена стойкости к канамицину переваривают Xho и полученный продукт очищают путем экстракции фенолом и обработки простым эфиром и осаждают э ганолом.

Полученную таким образом ДНК рАСУС 177, расщепляют Xho I и смешивают с HBV ДНК с концом Xho 1, в малярном отношении 1:5, и смесь сшивают, ДНК-лигазой Т в течение 18 ч.

ДНК (10 мкл), полученную как описано выше, вводят в жидкость, содер- 35 ,жащую Е.coli (0,1 мл), которую приготавливают путем обработки бульона выращивания Е.col.1 х 1776, смесь тщательно перемешивают и выдерживают при

0 .С в течение 25 мин. Зту смесь нано- 40 о сят на чашку с I.-àãàpoì, содержащим ампициллин (20 мкг/мл), d-биотин (1 мкг/мл), диаминопимелиновую кисло ту (100 мкг/мл) и тимин (20 мкг/мл) и термостатируют в течение ночи. По4 лученные колонии наносят на чашку с агаром, содержащую канамицин (20 мкг/мл), и отбирают колонии, которые лишь на чашке с агаром, содержащей ампициллин рАСУС 177 содержит

50 стойкий к ампициллину ген и стойкий к канамицину .ген, но когда вводится

HBV ДНК в сайт гена Xho I стойкости к канамицину, то он теряет стойкость к канамицину. В связи с этим отобранные колонии включают. соответственно рекомбинантную ДНК. Из отобранных таким путем колоний приготавливают плазмиду.

Полученную плазмиду, т.е. рекомбинатную ДНК рАСУС177-НВЧ (которую обозначают "рНВЧ") обрабатывают Xho l при тех же условиях, что описаны выше, в результате чего получают общий фрагмент HBV ДНК (3,2 кв). Кроме того, когда эту плазмиду обрабатывают

Xho I u Bam Hl то получают фрагмент (примерно 1,3 кв), содержащий ген

HBs Ag.

HBV ДНК, полученную путем обработки плазмиды pHBV (рАСУС 177-HBV

ДНК) посредством Xho I, рекомбинируют с расщепленным Xho I челночным вектором, рАМ 82, в молярном отношении

5:1 путем термообработки с ДНК-лигазой Т при тех же условиях, что описаны выше. (Е.cali х 1776 трансформируют данной реакционной смесью и плазмидную

ДНК выделяют из стойких к ампициллину трансформантов таким же образом, как описано выше. Полученные таким путем

ДНК анализируют различными ограничительными ферментами, такими как Хйо Х и Hind III, и в результате определяют ввод HBV ДНК в векторы,и их направление.

Полученные плазмиды, выражающие ген НВз Ag, включают ген HBs и ген

НВс, идущие от гена кислой фосфотазы. !

Фрагмент гена HBs Ag (3 мкг), полученный путем расщепления плазмиды

pHBV посредством Bam Hl, обрабатывают

ДНК полимеразой Т, (0,2 U) в растворе (100 мкл) 67 мМ Трис-НС1 (рН 8,6), 6,7 мМ МРС1, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 6,7 мМ ЕДТА и 16,7 мМ (NH<) SOq, который содержит 200 мМ ATP, a СТР, Ы TTP и d ÑTÐ, в течение 30 мин с тем, чтобы заполнить расщепленный .

Bam Hl конец. Реакционную смесь подвергают экстракции фенолом и осаждению этанолом. Полученные осажденные продукты подвергают реакции связывания со связующим звеном Xho I в мо" лярном отношении 1:10 с ДНК-лигазой

Т в тех же условиях, что описаны выше. После экстракции фенолом и осаждения этанолом полученную плазмиду обрабатывают Xho I, в результате чего получают фрагмент гена HBs Ag (примерно 1,3 кв), имеющий по обоим концам Xho I. Полученный фрагмент сшивают с челночным вектором рАМ 82, который расщепляют посредством Xho 1 в молярном отношении 5:1 с использо"

1393317 ванием ДНК-лигазы Т, и Е.coli x х 1776 трансформируют полученной реакционной смесью.

Исходные дрожжи представляют собой

Бассйагошусез cerevisiae АН22 (а, 5 ,с(т

Leu 2, his 4, «anl ), которые были сданы на хранение в Научно-Исследова-+ тельский Институт Ферментации, Агентство промышленных исследований и тех- 10 нологии, Япония, Budapest treaty, где им присвоено официальное название

"ГЕКИ BP-312". Эти исходные дрожжи инокулируют в среде УРД (100 мл), содержащей 2Х полипептона, 1Х дрожжево-15 го экстракта и 2Х глюкозы и смесь термостатируют при температуре 30 С о в течение ночи и после этого клетки извлекают путем центрифугирования.

Извлеченные клетки промывают стерили- 20 зованной водой (20 мл) и суспензируют в растворе (5 мл) 1,2 м сорбита и

100 мкг/мл эимолиазы — 60 000 (поставляется фирмой Seikagaku Kagyo

К.К., Япония), и суспензию выстаивают 25 при 30 С в течение 30 мин и в результате получают сферопласт. Приготовленный таким образом сферопласт промывают 1,2 М раствором сорбита три раза и затем суспендируют в растворе (0,6 мл) 2 М сорбита, 10 MM СаС1 и 10 мИ Трис-НС1 (рН 7,5). Полученную суспензию разделяют на небольшие пробирки объемом 60 мкл. К суспензии добавляют раствор рекомбинантной плазмиды рАН 203 (30 мкл). После тщательного перемешивания к нему добавляют 0,1 M СаС1 (3 мкл) до конечной концентрации СаС1 10 мИ и смесь отстаивают при комнатной температуре в течение 5 — 10 мин. В каждую полученную смесь вводят 1 мл раствора

20Х-ного полиэтиленгликоля 4000, 10 мМ СаС1 и 10 мИ Трис-НС1 (рН

7,5) и смесь отстаивают при комнатной 45 температуре в течение 20 мин. Полученную смесь (каждую по 0,2 мл) вводят в среду (10 мл), содержащую, Х: сорбита 22, глюкоза 2, аминокислота

0,7 на основе дрожжевого азота, УРД

2, 20 мкг/мл гистидина и агара 3, который поддерживается при температуре о

45 С. После осторожного перемешивания смесь наносят на слой с минимальной питательной средой, содержащей 1,2 И сорбита, которая была получена предварительно и содержит, : аминокислоты 0,7 на основе дрожжевого азота, глюкозы 2, 20 мкг/мл гистидина и агара 2, и оставляют на этом слое. Чашку термостатируют при температуре 30 С, в результате чего получают Колонию не требующих лейцин дрожжей. Эту ко-, лонию термостатируют в минимальной питательной среде Burkholder с добавлением гистидина (20 мкг/мл), в результате чего получают трансформированные дрожжи: Saucharomyces cerevisiae рАН 203.

Каждую колонию трансформированных дрожжей наносят на чашку с агаром с содержанием минимальной питательной среды Burkholder, с введенным гистидином (20 мкг/мл) и термостатируют при температуре 30 С, в результате чего образуется колония. Полученные клетки отделяют от данной колонии, инокулируют в минимальной питательной среде Burkholder, в которую введен гистидин (20 мкг/мл),и TepMocTaTHpytoT при температуре 30 С. По прошествии примерно 24 ч клетки в фазе логарифмического роста извлекают путем центрифугирования, суспендируют в минимальной питательной среде (10 мл), не содержащей фосфорную кислоту,,которую приготавливают путем замены

КН РО в минимальной питательной среде Burkholder хлористым калием, с последующим вводом гистидина в количестве (20 мкг/мл) с концентрацией клеток примерно 4х10 клеток/мл.

После термостатирования при темперао туре 30 С в течение примерно 24 ч питательный бульон культуры центрифугируют при скорости вращения центрифуги 4000 об/мин в течение 10 мин, собирая указанные клетки. Отделенные таким образом клетки суспендируют . в растворе (3 мл) 1,2 М сорбита, 50 мМ буферного раствора фосфата (рН 7,2), 14 мМ 2-меркаптоэтанола и 100 мкг/мл зимолиазы 60000 (поставляется фирмой

Seikagaku Kagyo К.К., Япония), и смесь осторожно взбалтывают при температуре 30 С в течение 30 мин, в результате чего получается сферопласт.

Этот сферопласт извлекают путем центрифугирования и тщательно суспендируют в растворе (1 мл) 0,1Х-ного тритона Х-100 и 50 мМ фосфатного бу- фера (рН 7,2), интенсивно перемешивают и затем центрифугируют при скорости вращения центрифуги 7000 об/мин в течение 10 мин и полученный поверх1393317

10 ностный слой извлекают как лизированНый дрожжевой раствор, Этот лизированный раствор подвергают испытанию с H13s антигеном RIA

kit (полученным АЬЬо CUJA) на активНость к антигену НВз. Результаты испытаний представлены в табл.1.

Т а блица 1

АктивКлон, Ф

Плаз-мида

Хозяин ность

HBsAg (отсчет в мин) . 15

S.Cerevisiae рАН ?03 13 008

АН22 (FERMBP312) рА 101. 1 200 20

ЭтарАМ 82» 320 лон

* Данный вектор не имеет гена HBV или HBs и используется как негативный эталон. 25

Полученный таким образом фрагмент переваривают с челночным вектором рАМ 82 который расщепляется посредством ХЬо I в молекулярном отношении

5: 1 с использованием ДНК-лигазы Т4 .

Данную реакционную смесь используют для трансформации Е.coli в результате чего получается плазмидная ДНК. В

55 полученную плазмиду вводят ген НВсА ниже фосфатазного стимулятора вектора рАМ 82 и эту плазмиду обозначают рНС 301. (Негативный контроль RIA kit имеет активность 310 отсч./мин и его позитивный контроль имеет активность

17 500 отсч./мин). 30

Фрагмент гена НВсЛ@ приготавливают следующим образом.

Плазмиду pHBV (3 мкг) переваривают ,,с ограничительной эндонуклеазой Rsa I

:обычным образом. Реакционную смесь подвергают экстракции фенолом и осаждению этанолом. Полученные осажденные продукты подвергают реакции связывания с линером ХЬо 1 в молярном отношении 1:10 ДНК-лигазой Т . После эк- 40 стракции фенолом и осаждения этанолом полученные осадки подвергают перевариванию Xho I в результате чего образуется фрагмент гена НВс (примерно

0,7 кв), по обоим концам которого 45 имеется концевое расщепление Xho I.

Исходные дрожжи представляют собой

Saccharomyces cerevisiae AH 22 (a Leu

2 his 4 сап1 " ), которые были сданы на хранение в Научно-Исследовательский институт Ферментации, Агентство по промышленным исследованиям и технологии, Япония, Budapest treaty, где им присвоено официальное название "РЕИ1 ВР†3". Исходные дрожжи инокулируют в среде УРД (100 мл), содержащей, Х: полипептид 2, дрожжевой экстракт 1 и глюкоза 2,и смесь термостатируют при температуре 30 С в течение ночи, а после этого клетки извлекают путем центрифугирования.

Собранные таким образом клетки промывают стерилизованной водой (20 мл), суспендируют в растворе (5 мл) 1,2 М, сорбита и 100 мкг/мл зимолиазы—

60 000 (поставляемой фирмой Seikagaku

Kogyo К.К., Япония) и суспензию.вью стаивают при 30 С в течение 30 мин, в результате чего получают сферопласт. Полученный таким путем сферопласт промывают 1,2 M раствором сорбита три раза, а затем суспендируют в растворе (0,6 мл) 2 M сорбита, 10 мМ СаС11 и 10 MM Трис-НС1 (рН

7,5). Эту суспензию распределяют по небольшим пробиркам объемом по 60 мл.

К суспензии добавляют раствор рекомбинантной плазмиды 301 (30 мкл). После тщательного перемешивания к раствору добавляют О, 1 М СаС1 g (3 мкл) до конечной концентрации СаС1, равной 10 MM и смесь выстаивают при комнатной температуре в течение 5

10 мин. 13 полученную смесь добавляют в каждом случае 1 мл раствора 207-ного полиэтиленгликоля 4000Ä 10 мМ

СаС1., и 10 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), и эту смесь выстаивают при комнатной температуре в течение примерно 20 мин.

Полученную смесь (каждая по 0,2 мл) добавляют к среде (10 мл), состоящей из 22% сорбита,, 27 глюкозы, 0,7Е аминокислоты на основе дрожжевого азота

2Х УРД, ?О мкг/мл гистидина и 37 агара, которая поддерживается при постоо янной температуре 45 С. После слабого перемешивания смесь вводят в слой на чашке с минимальной питательной средой, содержащей 1,2 м сорбита, которая была предварительно приготовлена и состоит из 0,71 аминокислоты на основе дрожжевого азота, 27. глюкозы, 20 мкг/мл гистидина и 27 агара и оставляют на этой среде. Данную смесь

1393317

Т а б л и ц а 2

Плазмида Активность

HBsAg (отсчет в минутах) Хозяин рНС 301 4 989

S.Cerevisiae

АН22 ("FERM

BP-3 12") рАМ 82* 16 913

ВНИИПИ Заказ 1894/58

Тираж 520 Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 термостатируют при температуре 30 С, в результате чего получают колонии независимых от лейцина дрожжей. Данную колонию термостатируют в миниS мальной питательной среде Burkholder, в которую введен гистидин (20 мкг/

/мл), в результате чего получают желаемые трансформированные дрожжи Sacharomyces cerevisiae рНС 301. . 10

Каждую колонию трансформированных дрожжей наносят на чашку с агаром минимальной питательной среды Burk-, holder с введенным гистидином (20 мкг/мл), и термостатируют при о температуре 30 С, в результате чего образуется колония. Полученные клетки отделяют от данной колонии, инокулируют в минимальную питательную среду

Burkholder с введенным в нее гистиди- 20 ном (20 мкг/мл), и термостатируют при температуре 30 С. По прошествии

24 ч клетки в фазе логарифмического роста собирают и извлекают путем центрифугирования, суспендируют в 25 минимальной питательной среде (10мл), не содержащей фосфорную кислоту (которая получается путем вытеснения

КН РО в минимальной питательной среде Burkholder) КС1, с последующим 3{) вводом 20 мкг/мл гистидина при концентрации клеток примерно 4х10 кле6 ток/мл. После термостатирования при температуре 30 С в течение примерно

24 ч питательный бульон выращенной 35 культуры центрифугируют при скорости вращения центрифуги 4000 об/мин в течение 10 мин, в результате чего ° клетки извлекаются. Отделенные таким образом клетки суспендируют в раство- 4р ре (3 мл) 1,2 М сорбита, 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,2), 14 мМ 2меркаптоэтанола и 100 мкг/мл зимолиа зы-60 000 (поставляемой фирмой Seikagaku Kogyo К.К., Япония) и смесь ос- 45 торожно взбалтывают при температуре

30 С в течение 30 мин, в результате чего получается сферопласт.. Этот сферопласт извлекают путем центрифугирования и тщательно суспендируют a pa створе (1 мл) О, 1 Тритона Х-100 и

50 мМ фосфатного буфера (рН 7,2), тщательно перемешивают и затем центрифугируют при скорости вращения центрифуги 7000 об/мин в течение

10 мин и полученный всплывший слой извлекают как дрожжевой лизированный раствор.

Этот лизированный раствор (20 мкл) подвергают испытанию с НВС антигеном

RIA kit (поставляется фирмой Abbott, США) на активность антигену НВс.

Результаты представлены ниже в табл.2.

* Данный вектор не имеет ни гена

HBV ни гена HBs и используется как негативный эталон. (Негативный контроль RIA kit имеет активность 17 740 отсч./мин и позитивный контроль его имеет активность

446 отсч./мин.

Формула изобретения

Способ получения челночного вектора путем объединения фрагмента ДНК

Saccharomyces cerevisiae, содержащего

ars 1,2 1uori и селективный маркерный ген для отбора трансформированных

S.cerevisiae с фрагментом ДНК Esche

richia coli, содержащим ген репликации плазмиды, а также селективный маркерный ген для отбора трансформи-. рованных плазмидой Е.coli, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью создания высококопийного вектора, в

Есо RI сайт-плазмиды рВК 322 вводят ген кислой фосфатазы P60i вьделенный из банка генов.S 288 С дрожжей, далее обрабатывают эндонуклеаэой Sal I u

ДНК-лигазой Т4 и получают плаэмиду рАТ25, в Sal I сайт рАТ25 включают фрагмент ars I-trp I, вьделенный из плазмиды УР7, полученную плазмиду рАТ26 обрабатывают эндонуклеазой

Hind III и вводят фрагмент Leu 2 и

2 pori плазмиды pSLEI, после чего отбирают вектор рАТ77.