Способ получения производных гонадолиберина

 

Изобретение относится к пептидам , в частности к получению производных гонадолиберина формулы I: Gep- HiS-Trp-Ser-Tyr-X -Xj-Xj-Pro-Gly NHCjH, где Х - Gly, DPhe, DTrp, DAla, DLeu, трет.бутил DSer; Xg - Leu, Trp, Phe, Gin; X, - Gin, Leu. Цель - разработка способа получения новых соединений, повышающих способность к овуляции и спермиации стерляди . Получение целевых соединений ведут построением пептидной цепи твердофазным методом исходя из глицина и бенэгидриламингидрохлоридной смолы. К полученному глицилполимеру присоединяют соответствующим образом защищенные аминокислоты в последовательности , обусловленной пептидом формулы I с использованием карбодиимидного метода или метода активированных эфиров. От полученного при этом пептидил-полимера формулы II: Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X,-Xj-Xj-Pro-Gly-W. Y Y Y где Y - динитрофенил или тозил; Y - OBZl; W - бензгидриламин, отщепляют защитные группы и полимерную подложку. Испытания показывают, что указанные соединения способствуют овуляции рыб. 4 табл. i СО 00 со Од СО vj

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК всгсжи е

13 „", „)3

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

ВМЪЛИБТЕлА

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTKPblTHA (21) 3827701/23-04 (22) 21. 12. 84 (31) 4458/83 (32) 23.12.83 (33) HU (46) 15. 05. 88. Бюл. В 18 (71) Кезпонти Валто-еш Хительбанк РТ.

Инновациош Алап (HU) (72) Тамаш Гулиаш, Анико Хорват, Дьердь Кери, Карой Николич, Балаж Секе и Иштван Теплан (НП) (53) 547.964.4.07 (088.8) (56) Химия полипептидов./Под ред.

II.Катсояниса. М.: Мир, 1977, с.368. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ГОНАДОЛИБЕ РИНА (57) Изобретение относится к пептидам, в частности к получению производных гонадолиберина формулы I: GepHiS-Trp-Ser-Tyr-Х -Х1-X -Pro-Gly

NHC > H> где Х, — G 1 y DPhe, DT rp, DA1a, DLeu, трет.бутил DSer; Х

Leu, Trp, Phe, Gln, Х вЂ” Gln, Leu.

„SU „„1396970 А 5 5ц 4 С 07 К 7/06, А 61 К 37/02

Цель — разработка способа получения новых соединений, повышающих способность к овуляции и спермиации стерляди. Получение целевых соединений ве" дут построением пептидной цепи твер" дофаэным методом исходя из глицина и бенэгидриламингидрохлоридной смолы.

К полученному глицилполимеру присоединяют соответствующим образом защищенные аминокислоты в последовательности, обусловленной пептидом формулы I с использованием карбодиимидного метода или метода активированных эфи" ров. От полученного при этом пептидил-полимера формулы II:

Glp-Нiэ-Trp-Ser-Tyr-Х, -Хz-K>-Pro-Gly-W.

1 1 у т"

1 где Y — динитрофенил или тозил;

Y" — 0BZl; W - -бензгидриламин, отщепляют защитные группы и полимерную подложку. Испытания показывают, что указанные соединения способствуют овуляции рыб. 4 табл.

1396970

Изобретение относится к способу получения производных гонадолиберина — новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в рыбоводстве.

Цель изобретения — способ получения новых производных гонадолиберина — малотоксичных и значительно повышающих способность к овуляции и спермиации стерляди.

Производные гонадолиберина получают, используя метод синтеза пептидов в твердой фазе.

За ходом реакций следят с помощью теста с нингидрином. При обнаружении свободных аминогрупп ацилирование повторяют. В зависимости от природы аминокислоты продолжительность про- 20 цесса связывания составляет 1 — 16 ч.

Отщепление защитных групп и отде.ление пептида от смолы осуществляют с помощью жидкого безводного фтористого водорода в одну стадию. При при- 25 менении И " -динитрофенила удаляют защитные группы еще до отщепления смолы с помощью HF-отщепления. Защищенную пептидную смолу перемешивают в содержащем пропиламин диметилформамида и 30 после удаления растворителя обрабатывают обычным образом с помощью HF.

Если полученное соединение является пептидалкиламидом, то пептид отделяют от смолы путем алкиламмонолиза и затем в зависимости от характера защитных групп каталитически гидрируют и/или гидролизуют кислотой.

Сырой продукт чистят путем гельфильтрации на Сефадексе G 25, элюиро- 40 ванне ведут с помощью уксусно-кислых растворов.

Для дальнейшей очистки используют

HPhC-колонки (жидкостная хроматогра" фия высокого давления ) и/или хрома- 45 тографию на силикагеле. Чистоту пептидов исследуют путем аминокислотного .анализа и посредством тонкослойной хроматографии. R — значения тонкослойной хроматографии определяют на силикавеле (тонкая алюминиевая фольга). Merk с помощью следующих смесей растворителей:

Этилацетат:пиридин:уксусная кислота:вода 30:20:6:11

Этилацетат:пиридин:уксусная кислота:вода 60:20:6:11

Этилацетат:пиридин:уксусная кислота:вода 120:.20:6: 11

Этилацетат:пиридин:уксусная кислота:вода 240:20:6:11 н-Бутанол:уксусная кислота:вода:

: этилаце тат 1: 1: 1: 1 н-Бутанол:уксусная кислота:вода

4:1:1

Изопропанол: 1 М уксусная кислота

2:1

Этилацетат:пиридин:уксусная кислота:вода 5;5:1:3 н Бутанол:уксусная кислота:аммиак

1 концентрированный аммиак и вода =

1: 4): вода 6: 1: 1: 2

Метилэтилкетон:уксусная кислота:

:вода 125:15:20

Пример 1. D — Pbe6, Gln гон адолибер ин (М: 1 2 43 ) а). Синтез.

1,25 г (1 ммоль) бензгидриламиногидрохлоридной смолы (0,8 ммоль/г

Pierce) в течение 2 ч оставляют набухать в дихлорметане. При ацилировании с помощью аминокислот, смотря по обстоятельствам, повторяют следующий цикл, (см. табл.1).

После последней стадии вес GIpHislTosl-Trp-Serl0BZ1 l-Tyr l 0BZll-PPhe-Leu-G1n-Pro-Gly — пептидной смолы составляет 2,28 г. bW:1,05 г (66X).

М (gesch.) полученного пептида:1577. б), Отщепление с помощью HF.

К смоле добавляют 3 мл аниэола и

100 мг дитиотрейта (Dithiothrit), затем конденсируют в смеси 30 мл HF.

Смесь перемешивают в течение 1 ч при

ООС. Затем фторисный водород удаляют в токе азота, остаток суспендируют в абсолютном эфире и затем отфильтровывают. Твердый остаток промывают

50Х-ной уксусной кислотой. Фильтрат выпаривают при 37 С. Остаток подают непосредственно на гель-хроматографию а в). Гель-хроматография.

Полученное согласно предыдущему пункту вещество очищается на колонке с Сефадексом G 25 (2,5 100 см) с помощью уксусной кислоты в качестве элюирующей кислоты. Элюирование осуществляется с помощью абсорбции УФсвета при длине волны 280 нм, а также посредством тонкослойной хроматографии. Скорость элюирования составляет

15 мл/ч. Собирают фракции между 300 мл и 350 мл и лиофилиэируют. Вес 690 мг (55%). г). Препаративная жидкостная хроматография высокого давления, 1396970

Используется препаративная HPLCколонка (колонка для жидкостной хроматографии BblcoKoro давления) размером 2,5 45 см (С,-силикагель LRP-1, 13-24 мик. Ватман). Она уравновешена смесью 257. метанола с 757. 307-ной уксусной кислоты. После установления равновесия на колонку наносят 230 мг очищенного с помощью гель-хроматогра- 1р фии вещества, растворенного в той смеси растворителей. Элюируют с помощью градиента метанол(уксусная кислота, состав которого линейно изменяется между 257 метанола 757 30 -ной 15 уксусной кислоты и 407 метанола) и

607. 307-ной уксусной кислоты.

Скорость злюирования составляет

2 мл/мин, давление 3,5 ° 10 Па. Фракции детектируют с помощью УФ-света 2р с длиной волны 280 нм, их содержание контролируется с помощью тонкослойной, хроматографии. Вес чистого целевого продукта D — Phe, Gln — GnRH после лиофилизации составляет 133 мг. Это 25 соответствует в расчете на общее количество вещества 399 мг (327.) ощиI щенного целевого продукта. Rg=0,76;

Т.пл. 75 — 180 С (gj — 68,0 (С 30

О,1, О,! Н СН,СООН).

Аминокислотный анализ:

Gly: 1,02; Pro: 0,95, Leu: 1,00;

Phe: 1,02; Tyr: 1,01 Ser: 0,93;

His 0,99; Glu .1,96.

T.ïë. 175 — 178ОС, (Ы)" =-68 (с=

=О,1, О,! СН СООН).

Пример 2. Trp ", Gina — гонадолиберин. (М:!226). а) . Синтез.

Исходя из 2,5 r (1 ммоль) бензгидриламиногидрохлоридной смолы (0,4 мольэквивалент/г) описанным в примере в п;а) образом получается пептидная смола Glp-HistDNPI-Trp-Ser)0-BZI I

Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-Gly — смола. Вес пептидной смолы составляет 3,62 г;

W=1,12 r (767). (М полученного пептида: 1468). б). Удаление защитных групп и отделение пептида от смолы. Отщепление динитрофенильной защитной группы (DNP)..

Пептидную смолу в течение 1 ч при комнатной температуре перемешивают

B смеси 20 мл диметилформамида с

1 мл пропиламина. Затем смолу отфильтровывают и промывают дихлорметаном, затем — этанолом.

Расщепление с помощью HF.

После удаления динитрофенильной защитной группы описанным в примере 1 в и. б) образом отделяют пептид от смолы, а защитные группы — от пептида. По окончании обеих стадий остаются 0,8 г (65%) вещества. г). Гель-хроматография.

Работают указанным в примере 1 в п.в) образом. Вес собранных и лиофилизированных фракций составляет

520 мг (427). д) Препаративная жидкостная хроматография высокого давления.

Работают укаэанным в примере 1 в п.r) образом с тем отличием, что уравновешивание осуществляется с помощью смеси из 187 метанола и 827

30 -ной уксусной кислоты. Очищенное с помощью гель-хроматографии вещество элюируется из колонны с помощью смеси метенол/уксусная кислота, состав которой линейно изменяется между 18% метанола (827 307-ной уксусной кислоты и 35 метанола) и 657 307-ной уксусной кислоты. Фракционирование, а также прочие условия совпадают с таковыми примера 1 п.r). Вес лиофилиэированного целевого продукта составляет 380 мг (317) В. =0,66; 3 =0,57;

О 78, T. 160 оС 716 12 0 (С 01 1 ф Оф Н СН3СООН) В .Аминокислотный анализ:

Glu : 1,93; Gly : 2,04; Pro : 1,00;

Tyr=0,98; Ser: 0,93; .Trp : 1,86, His 1,03.

Пример 3. Trp>, Leu, des ко

Gly NH гонадодиберин -этиламид (М

=1198) . а) ° Синтез.

В качестве первой стадии синтеза

БОК-Pr известным способом связывают с хлорметилированной полистирольной смолой. 2 r полученной таким образом

БОК-Pl о-смолы (0,5 моль-эквивалент/

/г) в течение 2 ч оставляют набухать в дихлорметане и затем описанным в п.а) примера 1 образом постепенно связывают со смолой соответствующие защищенные аминокислоты. После пос" леднего цикла получают 3,02 г пептидной смолы Glp-His(DNP I-TrpSer(0BZI1-Tyr(0BZI (-Gly-Trp-Leu-Pro

5 1,02 г (832). (М полученного пептида: 1486). б). Удаление защитных групп и отделение пептида от смолы.

1396970

Сначала согласно и. 6) примера 2 отделяют динитрофенильную защитную группу от гистидина."Затем отщепляют пептид в форме этиламида от смолы.

Для этой цели на защищенную пептидную смолу наконденсируют 15 мл этиламина о и смесь перемешивают при 0 С в течение 3 ч. Избыток амина удаляют с помощью азота. После этого промывают метанолом, затем — диметилформамидом.

ДМФ-раствор выпаривают и получающееся в качестве остатка после выпаривания масло растирают с эфиром. Осадок отфильтровывают. 15

Полученное таким образом твердое вещество с целью удаления защитных групп обрабатывают согласно п.б) примера 1, газообразным фтороводородом.

Получают 710 мл (59 ) нонапептид- 20 этиламида.

r). Гель-хроматография.

Работают описаннным в п. в) примера 1 способом с колонкой из Сефадекса

С 25 и в качестве элюирующего средст- 2Б ва используют 30 .-ную уксусную кислоту. Вес собранных и лиофилизированных фракций составляет 490 мг (41 ).

Сырой пептид очищают далее на колонке с силикагелем 60 (230-400 меш. 30

Merck) размером 2 100 см, Элюируют смесью этилацетата с пиридином, уксусной кислотой и водой в соотношении

30:20:6: 11. проточная скорость составляет 3 мл/ч. Фракции по 4 мл соби- 5 рают (улавливают) и за элюированием следят с помощью тонкослойной хроматографии.

Соответствующие гонадолиберинэтиламиду Тгр, = des Gly NH фракции 40 определяются на основании аминокис- лотного анализа. Получают 320 мг (26 ) лиофилизированного материала..

Т.пл. 167 — 174 С, (с 3р — 5,9 (С=

=0 5; 0 1 Н СН СООН) В.,=0,61 R = 45

=0 42 Ву=0»75 °

Аминокислотый анализ:

Gly : 0,96; Gly . 0,97; Pro : 0,95;

Ьеу : 1 00; Ser : 0 89; Tyr : 1 02;

Trp : 1,88; His : 1,03.

П р.и м е р 4. Phe, Gln Гонадолиберин (М=1187). а). Синтез. 1,25 r (1 ммоль) бензгидриламиногидрохлоридной смолы (0,8 моль-эквивалент/г) оставляют на- 55 бухать в течение 2 ч в дихлорметане.

Из набухшей смолы описанным в примере

1 п.а) образом получают 2,9 г пептидной смолы Glp-HislTos(-Trp-Ser

) 0BZI1-Тут ОВЕТI-Gly-Phe-Сlп-Pro-Glyсмола 4Ы: 1,27 г (83%). М полученного пептида = 1521.

6). Отщепление защитных групп.

Защищенный пептид описанным в примере 1 п.б) образом обрабатывают безводным HF. Получают 980 мг (82 ) незащищенного пептида. в). Гель-фильтрация.

Сырой декапептидамид описанным в примере 1 п.в) образом очищают на заполненной Сефадексом G — 25 колонке с помощью 2М уксусной кислоты.

Выход: 576 мг (49 ).

r). Препаративная HPL-хроматография (жидкостная хроматография высокого давления).

Работают описанным в примере 1 п. г) образом с тем различием, что гель LRP-1 уравновешивается с помощью содержащего 10 метанола и 20 уксусной кислоты водного раствора. Элюируют с помощью линейного градиента, который содержит в 20 .-ной уксусной кислоте количество метанола от 10 с возрастанием вплоть до 25 (2 »

«150 мл). Затем продолжают элюирование с помощью содержащего метнол в возрастающем количестве от 25 до 40, линейного градиента (2 150 мл). Полученные фракции чистого пептида собирают и выпаривают. Выход: 448 мг (38 ), т.пл. 182 С; (с/1 g 21,0 (С

=О, 1, О, 1 Н СН СООН) .

Аминокислотый айализ:

Ser : 0,85; Glu : 2,05; Pro : 1,03;

GIy : 2,13; Tyr : 0,92, Phe : 1,00;

Н1з : 0,95; Trp : 0,81. Т.пл. 182 С.

Пример 5. Phe, Leu8 Гонадо7 либерии (М:1172). а). Синтез.

0,62 r (0,5 ммоль) бензгидриламиногидрохлоридной смолы (0,8 моль-эквивалент/г) оставляют набухать в те" чение 2 ч в дихлорметане. Затем описанным в примере 1 п.а) образом получают пептидную смолу: Glp-HislTosl

Trp-Ser(0BZIt -Тур-!0BZlI-G1ó Phe-LeuPro-Gly — смолу.

Выход: 1,33 г gM: 695 мг (92 ).

M полученного пептида: 1506. б). Обработка с помощью HF.

Защищенный пептид обрабатывают безводным HF описанным в примере 1 п.б) образом. Получают 510 мг (87 ) сырого декапептида. в). Гель-фильтрация.

1396970

Полученный согласно стадии б) сырой декапептидамид описанным в примере 1 п.в) образом очищается на колонке с Сефадексом G-25 с помощью 2М

5 уксусной кислоты. Выход: 363 мг (62%) . г) .Хроматография на силикагеле.

Для дальнейшей очистки пептида служит заполненная силикагелем 60 колонка размером 2 А!00 см, которая элю- 10 ируется приготовленной в соотношении

1: 1: 1: 1 смесью из н-бутанола, уксусной кислоты, воды и этилацетата ° Содержание фракций контролируется УФспектрально, а также с помощью тон- 15 кослойной хроматографии, Получают

299 мг (51%) чистого декапептидамида, Т.пл. 175-178 С, fd 3 D - 19,0 (С=0,1, 0,1 Н СН СООН).

К =0,55; Rf=0,39; К =0,62 ; К,=0,73, 20

Аминокислотный айализ:

Ser:0,91; Gln:0,97; Рго:1,07; Gly:

:2,12; Leu;1,00; Tyr:1,03; Phe:0,94;

His: 1,05.

В условиях способа, описанного в примере 1, получены соединения согласно табл.2 и 3 (примеры 6 — 9).

Проведены биологические испытания производных гонадолиберина, полученных в условиях предлагаемого способа. 30

Производные гонадолиберина вводились рыбам (стерлядь Acipenser Suthemis) путем внутримышечной или подкожной иньекции в дозах 0,1 мкг — 5 мг на 1 кг веса (см. табл.4).

Проведенные испытания показали, что аналоги гонадолиберина в укаэанном интервале доз способствуют овуляции рыб (стерлядь Acipenser Suthemis),, в то время как известное соединение 4р

D Ala des Gly GnR-этиламид в укаэанном интервале доз не оказывает воэ" действие на способность этих рыб к размножению.

Формула изобретения

Способ получения производных гонадолиберина общей формулы I: Gep-HisTrp-Ser-Tyr-Х „-Х -Х>-Pro-Gly NHC , 50 где Х, — Gly, DPhe, DTrp, DAla, DLeu, трет-бутил;

Х, — Leu, Trp, Phe, G1N;

Х - Сlп, Leu, О т л и ч а ю щ и Й с я тем ° что построение пептидной цепи осуществляют твердофаэным методом, исходя из глицина и бензгидриламингидрохлоридной смолы, с последующим присоединением к полученному глицилполимеру соответствующим образом защищенных аминокислот в последовательности, обусловленной пептидом общей формулы I с использованием карбодииьидного метода или метода активированных эфиров, и от полученного при этом пептидил-полимера формулы II

Т а б л и ц а 1

Продолжительность

Стадия Реагенты, рабочий хо перемешивания, мин

1 CH Cl, промывка 3 pass

2 33%-ная трифторуксусная кислота в смеси с

67% CH Clq промывка

3 раза

11 II

4. СН С1,промывка 3 раза

5 СНС1, промывка 2 раза

6 Смесь из 10%-ного триэтиламина и 90% CHCl, промывка 2-кратная

7 СНСlз, промывка 2кратная

8 Этанол, промывка

2-кратная

9 СН С1, промывка

2-кратная

10 3 ммоля БОК-аминокис1

1 лоты, растворенные в дихлорметане+ и 3 ммоля ДЦК или ДИК, раст" . воренные в СН С1

СН С1, промывка

2-кратная

Этанол, промывка

2-кратная

60 (поразному

При связывании GIn с помощью метода активного сложного эфира связывается через БОК-GIn-CNP; в случае пироглутаминовой кислоты работают без защитной группы.

Gl p-Н1з-Trp-S er-Tyr-X,-X 2-Х З-Pro-С1У-М, 1 ( у t YIl Yi где Y — динитрофенил или тозил;

Y I — 0BZ1

M — бензгидриламин, отщепляют защитные группы и полимерную подложку.

1396970

Т а б л и ц а 2

Угол оптическоРастворитель

Название соединения Т. пл., OC

ВыПри мер ход °

ro вращения (720

6 D-Trp, Phe, Leu -GnRH

168-170 — 15,5 О, 1

0,1 í. 0„69 32 уксусная кислота

? D-А1а, Ging — GnRH

182

32,3 1,0

0,55 43

8 D-Leu, Gin -GnRH

183"185 - 39,0 1,0

0,57 47

178-179 - 23,0 1,0

9 О-трет.бутил-D-Ser— и

-Gln -GnRH

0,63 37

1! Таблица3

Аминокислотный анализ соединений, соответствующих примерам 9-12

ПриSer Glu Pro мер

Gly Ala Leu Tyr Pke His Trp

6 087 101 1,12 1,04 — 100 092 095 102 187

7 0,91 1,90 0,95 1,10 1,07 1,00 1,02 — 0,95 0,92

8 0 97 2 01 1 07 1 00 2 12 1 01 0 93 0 91

9 1,87 1,98 1 05 1,07 — 1,00 0 96 — 1 03 0,83! .Таблица4

Число овулированных рыб, Х, под действием соединений по изобретению на стерлядь (Acipenser Suthemis) 5,0 мг/кг 10,0 вес

Соединение 0,1 по примеру. 300,0 500,0

25,0 50 0

100,0

2Q0 0

0,5 1,0

60 50.

0 30 30 50

0 0 0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

5

0 0

0 0, 0 0

0 0

0 0 10 20 40 70

0 0 20 40 50 80

0 10 10 10 10 0

0 0 0 0 10 20

30 0

0 0

0 10

30 10

0 0

0 0

0 0 0 0 0 10 30

0 0 0 0 20 10 30

10 0

10 0

П р и м е ч а н и е: В калщом случае и при каждой дозе обрабатывали по 10 рыб. 10 10 30 30 50 60 90 90

0,1 н. уксусная кислота

0,1 н. уксусная кислота

0,1 н. уксусная кислота