Циклический октапептид,обладающий гипотензивной активностью и устройство к действию карбоксипептидаз

 

Циклический октапептид формулы fLys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ifc-LeuT, обладающий гипотензивной активностью и устойчивостью к действию карбоксипептидаз .

COOS СОВЕТСНИХ

О«И5%

РЕСПУБЛИН

„„SU„„1114020

P

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Во :С 11 .) ""- Я

13„"" „13 яКБРИ );! Е< А

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР .

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИИ Ц ОТКРЫТИЙ (21) 3620454/23-04 (22) 13.07.83 (46) 15.07.86. Бюл. В 26 (71) Ордена Трудового Красного

Знамени институт органического синтеза АН ЛатвССР (72) Г.И.Чипенс, И.В.Гринштейне, P.Ý.Âåãíåð, И.П.Мисиня и В.Е.Клуша (53) 547.964.4.07(088.8) сю 4 С 07 К 7/069 А 61 К 37/02 (54) ЦИКЛИЧЕСКИЙ ОКТАПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ ГИПОТЕНЗИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ И

УСТОЙЧИВОСТЬЮ К ДЕЙСТВИЮ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ (57) Циклический октапептид формулы

Lys-Pro-Arg-Аге-Pro-Tyr-TMe-Leu обладающий гипотензивной активностью и устойчивостью к действию карбоксипептидаз.

1114020 (Lys-Argf

Изобретение относится к новому,биологически активному соединению—. циклическому октапептиду формулы 3.

: Ly s-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-I e-Leu обладающему гипотензивной активно- . стью и устойчивостью к действию кар, боксипептидаз, которое может найти применение в медицине.

Известен природный тридекапептиднейротензин формул г

Ф р-Glu- Leu-Tyr-Glu-Asu Lys-Pro"

-Avg-Avg-Pro-Tyr-7Pe Leu, обладающий гипотенэивным действием.

Известно, что фрагмент нейротен" зина последовательности 8-13:

Arg-Arg-Pro-Tyr-I7e-Leu, обладает полным спектром биологического действия нейротензина и в частности, гипотензивным действием.

Недостатком нейротекзина и его укороченного аналога является их быстрое расщепление в организме под действием карбоксипептидаз, что определяет кратковременность их действия.

Наиболее близким по химической структуре к описываемому октапептиду является циклический гексапептид формульi II обладающий гипотенэивным действием и устойчивостью к действию карбоксипептидаз j4). Недостатком его в сравнении с нейротенэином является

1 невысокая гипотензивная активность.

Цель изббретекия — новый аналог .нейротензнна, обладающий. более высокой гнпотензивкой активностью и устойчивостью к действию ферментов. ,l

Поставленная цель достигается циклическим октапептидом формулы Х °

Синтез циклического октапептида формулы 1 осуществляют твердофазным методом путем ступенчатого наращивания пептидной цепи, начиная с С-кон цевой аминокислоты, ковалентно связанной с полимерным носителем, с использованием дициклогексилкарбоди-. имида в качестве конденсирующего агента, с последующим отщеплением защищенного линейного октапептнда от полимерного носителя, циклизацией

° и удалением защитных групп

Для защиты < -аминогруппы аминокислоты используют трет-бутилоксикарбонильную группу за исключением

N-концевого лизина, где используют бензилоксикарбонильную группу. Для защиты боковых функциональных групп тнрозина, аргиника и лизина используют

10 соответственно бензильную, нитро- и .

:трет-бутилоксикарбонильную группы. Все аминокислоты имеют Ь-конфигурацию. .)

Твердофазный синтез защищенного октапептида осуществляют с помощью !

5 автоматического. синтезатора Beckman990 В" (США). В качесуве полимерного носителя используют хлорметилированный полимер BiO Bends с 1Х-ным содержанием дивинилбензола и емкостью

20 4,2 ммоль/г.

Гомогенность полученных соединений контролируют с помощью тонкослойной хроматографии и электрофореза.

Тонкослойную хроматографию осуществ.,25 ляют на пластинках с силикагелем фирмы."Иерк" (ФРГ) в следующих системах:

А. Хлороформ — метанол — уксусная кислота (9:1:0,5);

Б. Пиридин - уксусная кислота— вода — этилацетат (20:6:11:

:3925);

В. Хлороформ — метанол — уксусная кислота - вода (60:18:2:3);

Г. Хлороформ — метанол — уксусная кислота — вода (30:20:4:6);

Д. Этнлацетат — уксусная кислота— н-бутанол — вода (2: 1: 1: 1);

Е. н-Бутанол †пиридин — уксусная. кислота - вода (15: 10:3: 12).

Электрофорез проводят на бумаге

УЯ-17 (ГДР) в 1 н. уксусной кислоте (рН 2,1) прИ напряжении 30 в/см.

Электрофоретическая подвижность соединений приведена по отношению к гистидину (Е ). Вещества на хроматограммах и электрофореграммах детектируют с помощью реактива Сакагуси, Паули, а также нингидриновым и бен50 зиднновым реактивамй. Удельные углы оптического вращения измеряют на полярнметре "Perkin . Elmer-142 " (США).

Аминокислотный состав определяют ка анализаторе Мдоыпа Й (ФРГ) после

Я кислотного гидролиэа пептидов в течение 24 ч при 110 С в б к.соляной киси лоте, содержащей 17. фенола. Масс" спектр циклоаналога снимали на прибо1114020

10 ре "Varian MAT СН-5DF" и приставкой

EI-FI-FD.

Пример. Получение циклического октапептида формулы 2 ,А Е

N -бензилоксикарбонил-N -трет-6

-бутилоксикарбонил-лизил-пролил-N

-нитроаргинил-N -нитроаргинил-пролилв

-пролил-о-бе из ил-тироэ ил-изолейцил-лейцин (Й) Z Lys(Вос)-Pro-Arg(N0z)-Arg(N0z)4

1 г (0,62 ммоль) !и растворяют в

10 мл хлороформа и 10 мл диоксана, о при О С добавляют 590 мг (0,55 мМ) комплекса F представляющего собой

I комплекс пентафторфенола и N,N—

-дициклогексилкарбодиимида (3: 1) и оставляют на 12 ч при О С. Выпавший осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают, остаток растирают с эфиром. В итоге получают 1,0 г (91 )l<

Rp = 0,59 (Б) . —,Pro-Tyr (Bz1) -Ие-LeuOH.

Исходный Вос-Leu-полимер получают исходя из 5 r полимера и 7 r Boc-Leu.

Начальная емкость аминоацилполимера, определенная по привесу и данным аминокислотного анализа, составляет

5,0 ммоль|г полимера. Твердофазный синтез линейного защищенного октапептидилполимера проводят по программам 1 и 2, приведенным в табл. 1 и 2.

Защищенные аминокислоты присоединяют к пептидил полимеру карбодинмидным методой по программе 1, После завершения реакции на каждой стадии синтеза выполнялась программа 2 — повторение реакции конденсации и ацетилирование непрореагировав-30 ших аминогрупп уксусным ангидридом.

N трет-бутилокснкарбониламинокислоты перед загрузкой. в реактор синтезатора растворяют в хлористом

Ф метилене, Ы -трет-бутилоксикарбонил"

-N -нитроаргинил растворяют в хлористом метилене, содержащем 10 диметилформамида.

В итоге после отщепления полимерного носителя методом щелочного омы- 40 ления получают 6,7 r (4,2 ммоль) сырого продукта, который очищают на препаративной колонке с снликагелем, фирмы "Мерк" (ФРГ) с использованием в качестве элюента системы А. В итоге45 получают 2,9 г (46 ) защищенного линейного октапептида Щ, гомогенного по данным ТСХ: R(= 0,45 (А), 0,33 (Б), 0,86 (Д).

2. Пентафторфениловый эфир N †- 50

-бензилоксикарбонил-N -трет-бутипЕ»

9 оксикарбонил-лизил-пролил-N -нитроаргинил-N --нитроаргинил-пролил-о-бензил-тирозил-изолейцин-лецина (" )

Z-Lys(Boc)-Pro-Агд(ИО )-Агд(НО )-Pro- Tyr (Bz l ) - I 1е-LeuWP f p

Ш. Хлоргидрат пентафторфенилового с С . эфира N -бензнлбксикарбонил-лизил6. е

-пролил-Н -нитроаргинил-N -нитроаргинил-пролил-о-бензилтирозил-иэо- . лейцил-лейцина (К).

4,0 г (0,57 ммоль). и растворяют в 5 мл уксусной кислоты, добавляют

30 мл насыщенного раствора хлористого водорода в уксусной кислоте, через

30 миндобавляют сухой эфир, выпавший продукт отфильтровывают.

В итоге получают 0,800 г (84 ) 1

Rg =- 0,04 (Б).

G и . Цикло-(Н -бензилоксикарбоннл&

-лиэ ил-пролил-N -нитроар гинил-N—

-нитроаргинил-пролил-о-бе из ил-тирозил-изолейцил-лейцил) (Vl ) . .0,8 r (0,46 ммоль)у растворяют в смеси, состоящей из 40 мл днметилформамида и 800 мг перегнанного дно оксана. При 20 С по каплям при перемешивании добавляют 0,2 r (1,5 ммоль) дииэопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивают 64 ч, затем упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 10 мл смеси этилацетатэтанол (10: 1), осадок отфильтровывают, филь- трат упаривают и остаток растирают с эфиром. Полученный сырой продукт очищают хроматографически на препаративной колонке с силикагелем фирмы "Мерк" с использованием в качестве элюента системы. В итоге получают 220 мг (30 ) v>, Rf.=0,62 (Б), 0,56 (В) ° у . Цнкло- (лиэил-пролил-аргиннл-пролил-тирозил-изолейцил-лейцил) (I )

Lys-Pro-Arg Arg-Pro- Tyr-Ile Leu

220 мг (О, 15 ммоль) yl растворяют в 25 мл смеси метанол — уксусная кислота — вода (10: 1: 1), добавляют палладиевую чернь и гидрируют 20 ч.

Затем катализатор отфильтровывают, 1114020

S фильтрат упаривают, добавляют эфир и выпавший продукт отфильтровывают.

Получают 130 г (747) . Выделенный свободный пептид очищают хроматографически на носителе типа обратная фаза Zorbax С, с использованием в качестве элюента смеси, состоящей из

30Х. этанола и 707 0,25М водного раствора ацетата аймони 1. После упаривания растворителя остаток лиофилизуют О из воды. В итоге получают 27 мг (277) Я, Ry = 0,38 (Г) 0,12 (Д), 0 45 (E); E „; = Ов86, (с/.) =-67 5 (С = 0,2 метанол) .

Аминокислотный анализа: Pro 1,90 15 (Х); 38е 1,05 (Х); Leu 0,94 ();

Туг "0,88 (i); Lys 1,0 (1); Arg

2, 24 (t ) мол. вес 1023. Выход l рассчитывая на первую аминокислоту 8,7Х

Исследована биологическая актив- 20 ность описываемого циклооктапептида, в опытах invivon invitro. В качестве стандартного соединения использовали . синтетический нейротензин фирмы

"Sigma" (США). Для сравнения биоло- 25 гического действия использовали также циклический гексапептид Й .

В опытах in что изучена гипотензивная активность — влияние циклоок- ЗО тапептида Х на артериальное давление наркотизированных этаминал-натрием крыс обоего пола массой 200-220 г, имеющих начальное артериальное давление,120-140 мм рт.ст ° Исследуемые вещес,тва вводят в дозах 0,12525 н4/кг в бедренную вену. Артериальное давление регистрйруют из общей сонной артерии при помощи ртутного манометра. Полученные результаты40 представлены в табл. 3.

Миотропное действие циклического октапептида «7 изучают в опытах in

vitro на изолированной подвздошной кишке морских свинок обоего пола 4S массой 350-400 r.

Эксперименты проводят в изотони< ческом режиме по методу регистрацин кумулятивных кривых концентрация эффект с вычислением параметров: внутренняя активность о(.и сродство к рецептору pD (см. табл. 4). . Острую токсичность определяют

-на белых безлинейных мышах при внутривенном введении.

При исследовании влияния описываемого соединения (1) на артериальное давление наркотизированных крыс показано, что соединение в условиях опыта обладает значительным депрес,сорным действием. Эквидепрессорный эффект аналога достигается при дозах, в среднем, в два раза превышающих дозы нейротензина, за исключением дозы

5 нм/кг, которая вызывает одинаковый эффект у нейротензина и описываемого соединения (см. табл. 3). Сравнения с ближайшим структурным аналогом— гексапептидом Й показывает, что эквидепрессорный эффект аналога дос-. тигается в дозах в 10 раз превосходящих дозы описываемого. циклооктапептида.

В опытах п у йго установлено, что описываемый циклооктапептид обладает более йизкой миотропной активностью, чем нейротензин. Сродство к рецептору гладкой мускулатуры ниже примерно на два порядка при значительно сниженной внутренней активности (см. табл. 4), т.е. описываемый циклическйй октапептид обладает большей избирательностью действия.

3Щ,юдля описываемого соединения составляет 9 мг/кг, т.е. летальная доза более чем в 18000 раз превышает дозу, при которой наблюдается явный депрессорный эффект (0,5 мкг/кг).

Циклический октапептид L. устойчив к действию карбокснпептидазы В в среде 0,2 М буферного раствора ацетата

N-метилморфолина прн рН 8,5 и 37 С.

1114020

Т а б л и ц а 1

Программа 1 твердофазного синтеза на 10 г полимера (отщепление защитной группы и конденсация) Используемый реагент

Номер

Операция линий

1 Промывка

СнаС1а .

2 То же

1,5

5,0

50Х TFA/ÑÍ С1

4 Деблокирование

30,0

5 Промывка

40 х 6

СН,С1

1,5

6 Нейтрализация

25Х Е N/ÑH С1

40х2

1,5

40 х 8

7 Промывка

СН С1

1,5

0,5М ВОс-а.к./СН С1

1М DCC/Ñí С1

9 Добавление

10 Реакция конденсации

1,5

11 Промывка

40x5

Сн С1

Переход к 1-ой строке программы 2

8 Добавление Вос-аминокислоты

То же

50Х TFA/СН С1

Объем ре- Время переагента, мешивания, мл мин

1114020

Таблица 2

t. Программа твердофазного синтеза Ф 2 .(повторная конденсация и ацетилирование) Операция

1 Промывка

СН С1

2 То же

Снгс1г

1,5

25% EtgN/СН С1

40х2

Нейтрализация

40х8

4 Промывка

СН С1

t 5

5 Добавление Вос/аминокислоты

0,5М Вос-а.к./СН С1 20

6 Добавление

1М DCC/CÍ,C1

60

7 Реакция конденсации

40х5

8 Промывка

1,5

СН С1

9 То же

СН,С1,10% Ac 0/CH П

5,0

10 Ацетилирование

25% Ег И/СН С1

1,5

11 Нейтрализация

40 х 5

1,5

СНХС1г

1 2 Промывка

Номер линии

Переход к 1-ой строке программы i

Используемый реагент, Объем реагента, мл

Время.перемешивания, мин

1114020

Таблица 3 с

Влияние нейротензина и циклоаналогов 2 — И на артериальное давление крыс, наркотизированных зтаминал-натрием

Депрессорный эффект, мм рт.ст.

Доза, н м/кг (мкг/кг) Исследуемое вещество

22+2 4513 73Ф2

Нейротензин

Нет

28+3 73+4

80+2

13+1

Циклооктапептид Нет

: 4+1

26+1

Циклогексапептид П Нет

48+2

Нет

Таблица 4

Миотропная активность циклического октапептида

Внутренняя актив.ность, С

Сродство к рецептору рп

Исследуемое вещество

0,65 0,6

Циклооктапептид I

1,0

О, 71+0, 07

Техред М. Ходанич

Корректор Л. Патай

Редактор С. Герасимова

Заказ 3933/2

Тираж 343

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Нейротензин

Циклогексапептид 0

Ов125 (О ° 25) Оэ25 (Оэ5) Оэ5 (1,0) 5ъО (10) 25 (50) О ° 125 (Оэ137) О ° 25(Ов275) Оэ5(Оэ55) 5эО(5э5) 25(27э5) 0 э 1 25 (0 э 096) 0 э 25 (О э 1 92) 0 в 5 (0 ý 385) 5 э 0 (3 э 85) 25 (1 9 в 2) 6,95т0, 13

8,87-,0,09

6,57+0,18

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5