Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus для получения моноклональных антител к щелочной фосфатазе из кишечника теленка

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть цспользовано для выявления антигенов в иммуноферментиом анализе. Целью изобретения является новый штамм гибридных культивируемых мьшиных клеток, продуцирукяций моноклональные антитела к щелочной фосфатазе, Секретируемое клетками штамма моноклональное антитело связьшается с щелочной фосфатазой. не нарушая ее ферментативной активности, и может быть использовано для получения реагента, пригодного в иммуноферментном анализе. Штамм хорошо культивируется и легко может быть переведен в асцитную форму. i (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСН ИХ

РЕСПУБЛИК (511 4 C 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЪТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS ДЛЯ

ПОЛУЧЕНИЯ ЧОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К

ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЕ ИЗ КИШЕЧНИКА ТЕЛЕНКА (57} Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для выявления антигенов в иммуноферментном анализе. Целью изобретения является новый штамм гибридных культивируемых мышиных клеток, проду цирующий моноклональные антитела к щелочной фосфатазе. Секретируемое клетками штамма моноклональное антитело связывается с щелочной фосфатазой. не нарушая ее ферментативной активности, и может быть использовано для получения реагента, пригодного в иммуноферментном анализе. Штамм хорошо культивируется и легко может быть переведен в асцитную форму.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4114166/31-13 (22) 12.08.86 (46) 15.05.88. Бюл. 1Ф 18 (71) Всесоюзный онкологический научный центр AMH СССР и Всесоюзный кардиологический научный центр AMH СССР (72) Е, В. Мечетнер, А. В. Червонский и А. И. Фаерман (53) 578.085.23(088.8) (56) Analytical biochemistry. 1986, 154, 624-631.

I. Histochem Citochem. 1984,vol.32, 2, р.р. 219-229.

Л0„„ 1395668 А 1

1395668

Изобретение относится к биотехнологии И может быть использовано для выявления антигенов в непрямом методе иммуноферментного анализа.

Цель изобретения — новый штамм гибридных культивируемых мышиных клеток Мыз шпзси1пз„ продуцирующий моноклональные антитела к щелочной фосфатазе (ЩФ) из кишечника теленка. 10

Штамм получен путем слияния клеток селезенки мышей BAL В/с, предва.— рительно иммунизированных препаратом

ЩФ, с клетками миеломы Х63-Ag8.653 и последующего клонирования получен- !5 ных гибридов на селективной среде

ГАТ.

Штамм клеток МАМ-2108 депонирован ! в Специализированной коллекции .перевиваемых соматических клеток позво- 20 ночных института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) 63Д.

Культуральная характеристика. Среда для культивирования — среда

RPMI-1640 или модификация Дульбекко 25 среды Игла (ДМЕМ) с.10 -ной телячьей эмбриональной сывороткой, 4 мМ 1глутамина,,100 ед. гентамицина в 1 мл.

Культивирование проводят при 37 С с 5 -ной углекислотой в атмосфере или беэ углекислоты. э б

Посевная доза 5 1Π— 10 в 1 мл..

Частота пассажирования — через 4 дня.

Кратность рассева 1:4.

Штамм может K THÂHpoÂéT ñß B Gc 35 цитной форме.

Сведения о клонировании. Штамм четырежды клонирован методом конечных разведений. Позитивных клонов не менее 95, 40

Сведения о контаминантах линии.

Бактерии и грибы не обнаружены. Заражение микоплазмой не выявлено.

Криоконсервирование. Криозащитная среда — эмбриональная телячья сыворотка с добавлением 10 -ного диметилсульфоксида. Выживаемость при размораживании 75-90%.

Морфологическая характеристика. 1

Модальное число хромосом 72, с областью варьирования от 68 до 76. В кариотипе 2 маркерные (метацентрические) хромосомы.

Полезный продукт. Секреция моноклональных антител на 4 день культи-, вирования. Получаемое антитело относится к 1 gG, подклассу и связывает

ЩФ из кишечника теленка не инактивируя активный центр, Использование штамма MAM-2108 иллюстрируется следующими примерами.

II р и м е р 1. Гибридомные клетки помещают в пластиковые флаконы плоплощадью 25 см по 5xiO клеток, в

5 мл среды ДМЕМ с 10 -ной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мм глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл пенициллина. Клетки культивируют

4 дня при 37 С в атмосфере, содержащей 5 СО . Культуральную среду собирают, центрифугируют 10 мин при

800 об./мин при 4 С. К полученному супернатанту добавляют ЩФ из кишечника теленка до конечной концентрации 10 мкг/мл. Полученную смесь используют в качестве ШФАЩФ-реагента для иммуноферментного анализа.

Пластиковые планшеты для микротитрования покрывают очищенным в иммуноаффинной хроматографии альфа-фетопротеином человека (АФПЧ) (инкубация— !

2 ч при 4 С, концентрация АФПЧ

1 мкг/мл ЗФФР, по 50 мкл/лунку). За тем лунки 5 раз отмывают ЗФФР, свободные валентности полистирола инактивируют бычьим сывороточным альбумином (0,5% на ЗФФР, 1 ч, 37 С), отмьгвают и инкубируют последовательно, с аналогичными отмывками, с моноклональными антителами к АФПЧ (контроль — ростовая среда) в различных разведениях, с кроличьей антисывороткой к иммуноглобулинам мьппи и с

ЩФАЩФ-реагентом. Время инкубации ч.

После этого лунки отмывают 5 раэ и заполняют субстратом-хромогеном (рнитрофенилфосфат в концентрации

1 мг/мл, на трис-НС1-буфере, рН 9,2 и 0,01 MgC1 ). Положительная реакция проявляется пронзительно-желтым окрашиванием, которое оценивают в относительных единицах оптической плотности на приборе "МИНИРИДЕР" (фирма

"Дайнатэк", Швейцария). Позитивная реакция сохраняется до разведения моноклональных антител к АФПЧ

1:1200, что соответствует концентра- . ции антител 20 нг/мл.

Пример 2. Криостатные срезы почки человека, фиксированные

10 -ным раствором формалина, инкубируют при комнатной температуре с моноклональным антителом 9В9 против ангиотензин-превращающего фермента (10 мкг/мл) в ЗФФР и затем последовательно с козьей антисывороткой к иммуноглобулинам крысы (KAM)(1:40) 1395668

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК(П)

63Д для получения моноклональных ан-. тител к щелочной фосфатазе из кишечника теленка.

Составитель О. Жакетов

Редактор М. Недолуженко Техред H.Bepec Корректор А. Тяско

Заказ 2466/26 Тираж 520 Подпи,сное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 и ЩФАШФ-реагентом из примера 1. Время каждой инкубации 30 мин, между отмывками (по 10 мин) срезы слегка встряхивают (B ЗФФР) ° После последней отмывки активность ЩФ, входящей в состав ЩФАЩФ-реагента, выявляют инкубацией срезов в течение 30 мин. в 0,1 И трис-НС1-буфере, рН 8,7, содержащем 0,5 мг/мл нафтола AS-MX, 10 ! мг/мл прочного синего ВВ и 1 мм левамизола, подавляющего активность эндогенной щелочной фосфатазы. Затем срезы отмывают в дистиллированной воде .и заключают в гумми-сироп Апати,. 15

При микроскопии препаратов усгановлено, что синий продукт фосфатазной реакции, соответствующий искомому ферменту, локализуется на апикальной поверхности клеток проксимальных 20 канальцев почки. При этом в контрольных срезах (обработка КАМ и

ЩФАЩФ-реагентом) фосфатазная активность отсутствует.

Таким образом, проведенные испытания показали, что моноклональное антитело, продуцируемое новой гибридомой, может быть применено для получения реагента, используемого в иммуноферментном анализе. Воэможность тиражирования штамма в виде асцитов обеспечивает получение целевого продукта в достаточном количестве.