Способ определения содержания нативной формы ферредоксина в его препаратах

 

Изобретение относится к области биоэлектрохимии. Цель изобретения - упрощение процесса, улучшение воспроизводимости и сравнимости результатов . Цель достигается тем,что снимают циклические вольт-амперные кривые на золотом электроде,модифицированном ди-(4-пиридил)-дисульфидом , при начальном потенциале (-0,4)- (-0,1)В, потенциале точки поворота (-0,78) - (-0,80)В и скорости развертки потенциала 0,16-0,5 В/с. Концентрация ферредоксина (1,9 -3 ,8) 10 моль/л. 1 з.п. ф-лы,1 ил., 2 табл. i (Л

. СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) А1 (5)) 4 G 01 И 27 8

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

lntdi iОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ . и

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4081159/31-25 (22) 20.06.86 (46) 23.03.88.Бюл. Р !1 (71) Институт биохимии им.А.М.Баха и Институт почвоведения и фотосинтеза АН СССР (72) Г.П.Шумакович, Б.А.Кузнецов, И.В.Березин, В.К.Гинс и Е.Н.Мухин (53) 543.257 (088.8) (56) Гинс В.К. и др. Светозависимое восстановление НАДФ в хлоропластах н активность гликолактоксидаэы у яровых пшениц разной продуктивности в онтогенезе. — Физиология растений, 1985, т.32, вып.l с.53-59.

Гейровский Я., Кута Я. Основы полярографии. - M.: Мир; 1965, с.474. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ

НАТИВНОИ ФОРМЫ ФЕРРЕДОКСИНА В ЕГО

ПРЕПАРАТАХ (57) Изобретение относится к области биоэлектрохимии. Цель изобретения — упрощение процесса, улучшение .воспроизводимости и сравнимости результатов. Цель достигается тем,что снимают циклические вольт-амперные кривые на золотом электроде,модифицированном ди-(4-пиридил)-дисульфидом, при начальном потенциале (-0,4)— (-0,1)В, потенциале точки поворота (-0,78) — (-0,80)В и скорости развертки потенциала 0,16-0,5 В/с.

Концентрация ферредоксина (1,9 — а

3,8) 10 моль/л. 1 э.п. ф-лы,1 ил., 4 -)9

2 табл.

Изобретение относится к области биоэлектрохимии, касается способа идентификации йативного состояния ферредоксина электрохимическим Мето5 дом и может быть использовано для исследований в бисдимии, физиологии растений, молекулярной биологии для анализа содержания в гомогенных препаратах ферредоксина нативной формы и его способности участвовать в реакциях, связанных с переносом электронов, включая фотовосстановление

НАДФ, фиксацию азота и углекислоты.

Цель изобретения — упрощение анализа и улучшение его воспроизводимости.

На чертеже представлены вольтамперограммы 0,31 мМ свежевыделенного ферредоксина и электролита на золотом 20 модифицированном (кривые 12 и 1,2 соответственно) и немодифицированном (кривая 3) электроде.

Способ осуществляют в несколько стадий: модификация золотого элект- 25 рода, проведение электрохимическОй реакции и регистрация вольт-амперной кривой, анализ вольт-амперной кривой и расчет числа переносимых электронов.на молекулу ферредоксина.

Модификацию золотого электрода проводят путем покрытия поверхности пленкой необратимо адсорбированного мостикового переносчика ди-(4-пиридил)-дисульфида, Необходимо исполь35 зовать высокоочищенный препарат моди11 ° 11 ик ат о ра, например, фирмы Sigma лек трохимичес кую реакцию ферредоксина и снятие в оль тамперограммы проводят в области потенциалов (-0, 4 ) . . ° 40 (-О, 7 8 ) В .

Модифицирующе е покрытие стабильно в области рН 7 . . . 8, 2, которая рекоменр ован а для пров едения элек трохимиче ской реакции фе рредок син а (ферре45 доксин в этой области рН проявляет максимальную активность в реакции фотовосстановления НАДФ ) °

Следующая стадия — проведение электрохимической реакции и снятие вольт-амперной кривой.

Обратимый электродный процесс с диффузионным ограничением для стационарного электрода описывается уравнением, Ъ|2 . 112 1!а

I = 0,272 n D V qC, (1) где I p пиковое значение тока, А;

n — число переносимых. электронов;

q — - площадь электрода, см

2, D — коэффициент диффузии, равный для ферредоксина 1,2 х х IÎ см2/с;

V — скорость развертки потенциала, В/с;

С вЂ” концентрация белка, мМ.

Электрохимическую реакцию ферредоксина и фиксирование вольтамперограммы рекомендуется проводить в следующем оптимальном режиме: концентрация ферредоксина 0,2...0,4 мМ; рН 8,0;ионная сила 0,1...0,17 м; скорость развертки потенциала 0,25 В/с; начальный потенциал (-0,1)...(-0,4)В.

Делают также контрольные измерения: получают вольт-амперную кривую ферредоксина на немодифицированном золотом электроде и электролита на модифицированном,электроде.

Так как при первом сканировании волна восстановления ферредоксина накладывается на ток восстановления ди-(4-пиридил)-дисульфида, начало волны ферредоксина не всегда хорошо выражено. По вольтамперограмме второго сканирования измерения могут быть сделаны точнее, так как реакция восстановления модифкатора необратима и при повторном сканировании не обнаруживается. Поэтому рекомендует, ся делать два последующих сканирования потенциала, только потенциал точки поворота прямоугольной развертки не должен превьппать (-0,78)... (-0,8)В (относительно насыщенного каломельного электрода).

При электрохимическом анализе мо 1 гут мешать электрохимически активные низкомолекулярные соединения, которые искажают вид полярограммы, напри- мер сульфид разложенного кластера.

Исследуемый раствор ферредоксина.до анализа необходимо очистить гель-. фильтрацией на сефадексе С-25 или диализом.

Следующая стадия — анализ вольтамперной кривой.

Сначала по вольт-амперной кривой. идентифицируют ферредоксин. Для этого находят редокс-потенциал реакции и сравнивают его со стандартным известным редокс-потенциалом. Потенциал катодного пика обратимого процесса смещен относительно редокс-потенциала на 29 мВ, потенциал анодного пика также смещен в противоположную

138З193 сторону, Разность потенциалов между катодным и анодным пиками характеризует обратимость процесса. Для обратимого процесса она равна 58 мБ. Для кваэиобратимой электрохимической реакции ферредоксина эта величина составляет 120 мВ, т.е. превышает теоретическое значение для обратимого од-. ноэлектронного процесса. Редокс-потенциал тем не менее может быть определен как средняя точка между потенциалами катодного и анодного пиков.

Для определения числа переносимых в реакции электронов находят высоту катодной или анодной волны.Способ расчета высоты представлен на чертеже. Измеряют высоту катодной (или,анодной) волны или пика Х от уровня тока контроля. В качестве такого уровня можно взять уровень тока электролита на модифицированном электроде. В этом случае ток восстановления поверхностно связанного ди-(4-пиридил)-дисульфида исключается. Измерение катодного пика ферредоксина делают после второго сканирования, при этом в качестве конт-. рольного уровня используют ток ферредоксина на немодифицированном электроде. Высоты волн, найденные этими двумя способами, совпадают.

После того, как найден катодный (или анодный),ток, представляют его значение в уравнение (1) и находят число переносимых электронов (n) ° Отношение найденной величины к 0,9, числу переносимых электронов, характерному для нативного ферредоксина, характеризует долю нативной формы в препарате. Число п для нативного ферредоксина меньше 1, по видимому по той причине, что на стадии межмолекулярного электронного обмена в адсорбированном слое электронный обмен несколько заторможен.

Пример l. Анализируют гомогенный препарат свежевыделенного из двухнедельных проростков гороха ферредоксина, который характеризуется отношениями пиков оптических плотностей А юо/A 77 = 0,54) А /А д,77

= 0,75.

Модификация электрода. Вначале поверхность золотого электрода тщательно полируют водной суспензией

Al 0 затем промывают бидистиллятом. Модификацию проводят путем пог45

Высоту волны находят как разность тока в максимуме катодной волны на вольтамперограмме, полученной при втором сканировании на модифицирован50 ном электроде, и тока при том же потенциале на катодной ветви вольтампербграммы ферредоксина, снятой на чистой поверхности электрода. В данном примере эта величина равна

I0 0 мкА. Тогда число переносимых

55 электронов, рассчитанное по уравнению (1), равно 0,85. Отсюда доля активной формы ферредоксина, оцененная этим способом, составляет 0,94..

10 I5

40 ружения электрода на 3 мин в 10 М раствор ди-(4-пиридил)-дисульфида в

O,l М К-фосфатном буфере, рН 7,0.

После этого электрод промывают в буфере в течение 1 мин и переносят в электрохимическую ячейку.

Электрохимическая реакция и снятие вольт-амперных кривых. Раствор ферредоксина предварительно очищают от низкомолекулярных соединений гельфильтрацией на колонке с сефадексом

С-25 (элюируемый раствор 0,15 М NaC1 в 0,02 M трициновом буфере, рН 8).

Анализируемый раствор, содержащий

0,307 мМ ферредоксина, 0,17 М БаС1 в 0,02 М трициновом буфере) рН 8,0 ° помещают в электрохимическую ячейку, предварительно освобожденную от кис.лорода. Температура в ячейке 20 С.

))

Раствор освобожпают от кислорода пропусканием очищенного водорода в течение I 5 мин. После этого в ячейку помещают модифицированный золотой электрод (q = 0,25 см ) и на него

2. подают начальное напряжение 0 ° ЗВ (относительно насыщенного каломельного электрода). Далее снимают две катодно-анодные вольт-амперные кривые со скоростью развертки 0 ° 25 В/с, потенциал точки поворота 0,78 В. В таких же условиях снимают вольтамперограмму ферредоксина на немодифицированном золотом электроде.

Анализ вольтамперограммы. Потенциалы пиков: катодного — 0,69В, анодного -0)57B. Потенциал средней точки между потенциалами катодного и анодного пиков равен -0,63 В и близок к стандартному редокс-потенциалу для растительных ферредоксинов (-0,62)... (-0,67)В. Катодный и анодный пики одинаковы, а разность потенциалов между ними составляет 120 мВ.

10

20

Т а б л и ц а 1

Преп рат

АктивДоля нативной формы

А .

geo ация, ММ ность, мкмоль

НАДФН/ мг хф.ч

277

0,38 0,53 0,75

16,5

0,87 0,97

0,62 0,69

0,56 0,62

0,33 0,37

0 0

0 25

0,65 0,79

144

0,79

0,41

134

9,0

0 59

4 025

0,40

0,63

3,0

О 24

О 36

0 5

II р и м е ч а н и е.. Поверхность электрода равна 0,36 см

Препараты 1-3 — свежевыделенные; 4 — хранившийся

2 мес при -5 С; 5 — термообработанный при 60 С в течение 10 мин.

5 13831

II р и м е р 2. Определение доли нативной формы ферредоксина в разных препаратах. Способ осуществляется согласно примеру 1 на препаратах ферредоксина, отличающихся спектральными характеристиками и активностью в реакции фотовосстановления НАДФ.

Результаты представлены в табл.1.

Из табл,l следует, что имеется корреляция между нативностью препарата, определенной согласно предлагаемому способу, и спектральными харак,теристиками и активностью в реакции фотовосстановления НАДФ

Пример 3. Определение доли нативного фермента в смеси двух ,препаратов ферредоксина, отличающихся в реакции фотовосстановления

НАДФ

Способ осуществляют сбгласно примеру 1 на смесях препарата ферредок.сина 2 и 4 (табл.1). Концентрация белка в образце 0,25 мМ.

Результаты представлены в табл.2.

Иэ табл.Z видно, что доля нативной формы ферредоксина, определенная вольтамперометрическим методом по числу переносимых электронов,линейно зависит от соотношения препаратов различной, активности в анаЛизируемой смеси.

Коэффициент корреляции для зависимости числа переносимых электронов от соотношения препаратов.ферредоксина различной активности составляет 0,997. Относительное среднеквадратичное отклонение тангенса угла наклона этой линейной зависимости равно 0,04.

Предлагаемый способ позволяет упростить определение нативной формы ферредоксина в его препаратах, Формула изобретения

1. Способ определения содержания нативной формы ферредоксина в его препаратах, заключающийся в регистрации перехода электронов в реакции восстановления-окисления, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения анализа и улучшения его воспроизводимости, регистрацию перехода электронов осуществляют путем снятия циклических вольт-амперных кривых с использованием золотого электрода, модифицированного ди-(4пиридил)-дисульфидом, при начальном . потенциале (-0,4)...(-0,1)B и потенциале точки поворота (-0,78)... (-0,80)В при скорости развертки потенциала 0,16 ° .,0,5 B/с и концентрации ферредоксина 1,9. 10 "...3,8 х х 10 моль/л.

2. Способ по и. l, о т л и.ч а ю— щ и и с .я тем, что снятие вольт-амперных кривых проводят последователь" но дважды и определение проводят по второй кривой.

1383193 .Габлица2!

Препа- Доля рат препа

Доля

1р мкА

Активата меси

0,33

0,37

0 48,9

2,5

0,46

0 41

3,5

4,4

0 48

0 53

0,52

0,58

5,2

0,7

1,0 144

0,62

6,5

П р и м е ч а н и е. Поверхность электрода равна 0,36 см

-05

-07 ность, мк моль

НАДФН/ мг хф«ч, 2 0,33 67,6

3 0 50 86 2

4 0,66 57,6 нативной формы