Способ определения канцерогенез-промоторной активности химических веществ

 

Изобретение относится к медицине , точнее к онкологии, и предназна-. чено для оценки безопасности химических веществ, используемых в пищевой промьщ1ленности, бытовой химии, в сельском, лесном хозяйстве, в химическом производстве. Цель изобрете ния - ускорение способа путем сокращения срока введения .исследуемого вещества и измерения силы сцепления клеток в органах животного. Испытуемое вещество вводят животному в дозах , образующих Логарифмический ряд. Через 24-48 ч животных забивают, органы извлекают и, отрывая стеклянной микроиглой клетки, расположенные на краю кусочка ткани, по величине прогиба иглы определяют силу сцепления клетки с тканью. При этом пороговой считается та доза вещества, при введении которой сила сцепления клеток достигает критического значения. Заключение о наличии каицерогенез-промоторной активности у исследуемого вещества делают на основании снижения силы сцепления клеток хотя бы в одной ткани Ниже критического значения. 5 табл. с (/) СО о К) ю а 05

СОЮЗ СОВЕ ТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1362266 (5 I ) 5 С 01 N 33/48 А 6! В 10/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (46) 30. 07. 90. Бюл. У 28 (21) 3973487/28-14 (22) 31. 10.85 (71) Всесоюзный онкологический науч- . ный центр ЛИН СССР и Научно-исследовательский институт по биологическим испытаниям химических соединений (72) И.М.Колотыгина, A.Ã.ÌàëåíêîH и Е.А.Модянова (53) 616.006-02 (088.8) (56) Goldsuorthy Т., Compfell H.A., Pitot С. Carcinogenesis 1984, v.5, И 1, рр.67-71 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КЛНЦЕРОГЕНЕЗ—

ПРОМОТОРНОИ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ (57) Изобретение относится к медицине, точнее к онкологии, и предназна-. чено для оценки безопасности химических веществ, используемых в пищевой промьпппенности, бытовой химии, в сельском, лесном хозяйстве, в химиГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ческом производстве. Цель иэобрете ния — ускорение способа путем сокращения срока введения. исследуемого вещества и измерения силы сцепления клеток в органах животного. Испытуемое вещество вводят животному в дозах, образующих логарифмический ряд.

Через 24-48 ч животных забивают, органы извлекают и, отрывая стеклянной микроиглой клетки, расположенные на краю кусочка ткани, по величине прогиба иглы определяют силу сцепления клетки с тканью. При этом пороговой считается та доза вещества, при введении которой сила сцепления клеток достигает критического значения.Заключение о наличии канцерогенеэ-промоторной активности у исследуемого seщества делают на основании снижения силы сцепления клеток хотя бы в одной ткани ниже критического значения.

5 табл.

266

Критическая сила сцепления клеток бпределена для печени,на уровне 0,10+

+0,005 мг/кл.

Эксперименты, кроме мьппей линии

С,„Ь1, ставились на линиях А/$п,СВА, а также беспородных крысах. Выбор линий определялся тем, чтобы выявить влияние промотора (фенобарбитала) на силу сцепления клеток в зависимости от исходной силы сцепления, характерной для данной линии. Данные приведены в табл. 2.

t f.362

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и может быть использовано для оценки безопасности химических веществ для выявления прос> моторной активности различных лекарств, субстанций лекарственных форм, веществ, используемых в пищевой промьппленности, бытовой химии, на химических производствах, в сельском и лесном хозяйстве, и определения доз веществ, при которых эта активность будет проявляться.

Цель изобретения — ускорение способа за счет сокращения срока введения исследуемого вещества и последующего измерения изменения силы сцепления клеток в органах животного.

Способ осуществляют следующим образом. 20

Животным (линии устойчивые к спонтанному бластомогенеэу) в молодом возрасте вводят исследуемое вещество в интересующем дозовом интервале, который лежит в пределах нетоксических доз. Через 24-48 ч животных забивают, органы извлекают и, отрывая стеклянной микроиглой с помощью микроманипулятора клетки, расположенные на краю кусочка ткани, по величине про- З0 гиба иглы определяют силу сцепления клетки с тканью. Заключение о наличии промоторной активности у исследуемого вещества делают на основании снижения силы сцепления клеток в хо- 35 тя бы одной ткани ниже критического значения. При этом .пороговой счита. ется та доза вещества, при введении которой сила сцепления клеток достигает критического значения. Критичес- 40 кие значения сил сцепления клеток в разных тканях определяют предварительно.

Измерение силы сцепления клеток осуществляют по методу Комана следу- 45 ющим образом.

Кусочек ткани закрепляют на предметном стекле желатиной. Затем под контролем микроскопа в клетку, находящуюся на краю кусочка, втыкают мик- 50 роиглу (диаметр кончика менее микрона, игла откалибрована на величину прогиба с помо пью проволочных микрогрузиков). Иглу перемещают с помощью пневматического микроманипулятора

Фонбрюна, положение кончика иглы регистрируется окуляр-микрометром. После протыкания клетки иглой последняя постепенно отводится в сторону, так что создается отрывающее клетку от ткани усилие, при этом игла изгибается, а при отрыве клетки распрямляется. Фиксируется положение кончика иглы непосредственно до отрыва клетки и после отрыва. Для каждого кусочка ткани проводят 10-30 измерений сил отрыва отдельных клеток. Повторяют измерение на 3-5 животных для каждого варианта опыта. Величину силы сцепления выражают в мг/клетку, для чего используют калибровочный график: величина прогиба — сила, который строят для каждой калибровочной иглы, Испытуемое вещество обычно вводят животному в дозах, образующих логарифмический ряд, таким образом, как желательно испытать (в/б, per os в питье и т.n.)..Æèíoòíoå забивают растяжением шейных позвонков и быстро извлекают кусочки органов (печень, легкие, иятовидную железу, аналогично можно определять силу сцепления почек, поджелудочной железы, желудка, слюнных желез, матки, молочной железы), освобождают их от.капсулы и помещают на время измерений в раствор Эрла,при. комнатной температуре.

Способ поясняется следующими примерами.

Л р и м е р 1. Определяют пороговые дозы промотора канцерогенеза печени — фенобарбитала. Мыши линии

С, Ь1 в возрасте 2 месяцев получают разные дозы фенобарбитала в течение

2 суток. Затем мьппей забивают и определяют силу сцепления клеток в печени. На каждую точку берут по 3 мы-ши. В каждой печени измеряют по 20 клеток. Результаты этого опыта представлены в табл. 1.

Сила сцепления клеток в печени при различном содержании фенобарби- . тала в диете.

Таблица 1.

Заключение

Содержание

20 фенобарбитала в диете, X

25.

Сила сцепления клеток в печени

О, 145+0, 015

О, 121+0, 010

0,002. Не обладает промоторной активностью

Пороговая доза

0,01

0,098+0 003

Наличие

0,073+0,003

0,025

-промоторной актив ности

0,072+0,003

0,05

Т а блица 2

Линейные и видовые отличия влияния различных концентраций фенобарбитала на силу сцепления клеток печени в 3 от исходной величины

-48+6

-26+6.

-50+ +1

-28+3

-51+4

0,05-0,1

-35+ 1

-15+8

-33+3

0,02 з 13622

Из данных табл, 2 видно, что дозы фенобарбитала, вызывающие промоторный эффект, снимают сцепление ниже лоро" гового значения, определенного независимо для спонтанного канцерогенеза.

Величина эффекта больше у "сильно сцепленных" линий С <,bl или беспородных крыс и тем меньше, чем меньше исходное значение силы сцепления, Пример 2. Определяют канцерогенеэ-промоторную активность бутилгндрокснтолуола (ионола) как описано в примере 1. В табл. 3 и 4 представлены результаты изучения влияния ионола на силу сцепления клеток.легких и печени.

Видно xopomee соответствие порогов промоторного эффекта и снижения силы сцепления ниже порога, опредвленного независимо на моделях спонтанного канцерогенеза.

Пример 3. В табл. 5 приведены данные о соответствии между эффектом веществ на силу сцепления в ткани и наличием у этого вещества промоторного эффекта на данный орган.

Данные о промоторном эффекте вы ражаются в полулогарифмическом масш- зп табе, поэтому пороговая доза приводится с точностью до полупорядка.

Положительный эффект предлагаемого способа в сравнении с прототипом заключается в том, что эффект промотора оценивается через 1-2 суток пос-35 ле начала эксперимента, а не через.

7-8 месяцев, что дает выигрыш во времени в 100-150 .раэ.

40 формула изобретения

Способ определения канцерогенезпромотррной активности химических веществ путем введения разных доэ исследуемого вещества экспериментальным животным с последующим извлечением органов и их исследованием, о т - . л и ч а ю шийся тем, что, с целью ускорения способа, животных, забивают через 1-2 суток после введения исследуемого вещества, определяют силу сцепления клеток в органах и при значении этого показателя ниже значения критической силы сцепления клеток хотя бы в одной ткани определяют канцерогенез-промоторную активность вещества.

1362?66

Продал)((ение табл. 2

-15+9

О, 004

-4+1,4

-17+ 9

"15+2

Сила сцепления у интактных ш(вотных»

О, 148+0,005 0,121+0,.004 0,071+0,003 0,114t0,003

7 ° пюмц ° 3 ьлмююие помола не clltty Сцсппеиию клаток Латине (° юг/клетку) wseA А/622 при юаеленнн помола а разине сроки после ° веление

Поза ионола, мт/нг

Ьреие horne аееленнк помола

22 (22

Наличке промотормого зЬ(2екта

7 сут а,)6 2 0,01

0,ЭЬ Ь 0,01

0,36 2 0,01

Еонтропь

0,33 ь 0,013

0,32 ь 0 ° 01

Нет

0 25 0 015 в а в

0272001 вв в

016 2001 ч

0 15 2 0 01 ь ° в

015+001 в в ч

0 t7 t A 02 в в

Та блица 4

Влияние ионола на силу сцепления гепатоцитов мьппей(А/s23 (в мг/клетку) в разные сроки после введения ионола н промоторный эффект

Наличие промоторного эффекта

Время после введения ионола, ч

Доза ионола, Мг/кг

24 48

Контроль

О, 122+0,002 О, 116+0,003 О, 12 1+0,002 Нет эффекта

0,8

4,0

Неопределенный эффект

20

02 077+02 002

О 075+0 002

2. = 2.

О 084+0 002

2. = 2.

Промоторный эф. фект на некоторых линиях

Промоторный, эффект

100

0,0 6 + 0 0015

О 069+0 0015

2. Л.

О 0?5+0 002

= L == = 2= = 2.

Подчеркнуты значения ниже порога (0,10); среднее значение силы сцепления — 0,12.15. Ф

Значение пороговой силы сцепления — 0,090-0,100.

0,35 I 0 ° Ot

0,36 ь 0.01

0 ° 34 (0,01

0,36 0,01

0,4 (0,01

Полчеркнуги значение силн сцеплению мнив порога устопчнлостн (ниве 0,3 чг/клетку)

Слепил зфЬехт ° 1,5-2 ° 0 раза, сильнип - полее чем е три разе.

О, 123+0, 002 О, 121+0, 002 О, 122+0, 0015

Оу! 16+0,002 О, 1 17+0 ° 003 О ъ 109+0 т 003

О, 102+0,002 О, 114+0, 003 О, 116+0,003

KcTI (елкою)

Есть (сильмьа)

Есть (сильнип) 1362266

Т а б л и ц а 5

Промоторная активность различных веществ и их влияние на силу сцепления клеток

Вещества

Щитовидная железа

Доза, мг/кг

Печень

Легкие

Фенобарбитал

33 + 3

51 « - 4»

00

Барбитал

Амобарбитал

Оь

8+ 7

17 «+ l1a

Нет данных

Тиобарбитуровая кислота

11+ 5

Ионол бутилгидроксианиэол 20-100

354-3

30 + 3»

52 1»

112

Нет данных

112

500

17-ный раствор

Дезоксихолевая кислота

40+ 1

50+ 5" — наличие промоторного эффекта. о — отсутствие промоторного эффекта.

0 - эффект меньше 5Е.

Составитель Н.Гуляева

Редактор М.Кузнецова Техред А.Кравчук . Корректор М.Демчик

Тираж 520 Подписное

ВНИКПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5 Заказ 2491

Производственно-полиграфическое предприятие, г ужгород, ул.Проектная,4

Пентабарбитал

Гексабарбитал.Арохлор 1254

Метилхолантрен

0,1Х-ный раствор в питье

40 + 6»

50+ 4

37+ 8

45+ 2»

40. + 5"

40 + 6»