Способ определения супероксидных анион-радикалов

 

Изобретение относится к области . биохимии. Для упрощения способа добавляют в систему генерации радикалов краситель и эквимолярную смесь карнозина и ионов двухвалентной меди в конечной концентрации 1-10 мМ с последунщей инкубацией, спектрофотометрией и определением результата по величине снижения скорости восстановления красителя. Для повьшения специфической активности реагента, связьтающего супероксидрадикалы, в смесь дополнительно вводят ионы двухвалентного цинка в эквимолярном соотношении, 1 з.п, ф-лы, 4 табл. i (/) ел to оо ГС vl

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

А1

„,SU 1352 2 g 4 G 01 N 21/27, 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ, (21) 4078636/28-14 (22) 30,06.86 (46) 15.11.87. Бюл. К 42 (71) Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии АН СССР (72) Н.В. Гуляева (53) 612. 015 (088. 8) (56) Methods in Enzymology, Acad, Press, N7., 1984, ч. 105, р. 394, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУПЕРОКСИДНЫХ АНИОН-РАДИКАЛОВ (57) Изобретение относится к области биохимии. Для упрощения способа добавляют в систему генерации радикалов краситель и эквимолярную смесь карнозина и ионов двухвалентной меди в конечной концентрации 1-10 мИ с последующей инкубацией, спектрофотометрией и определением результата по величине снижения скорости восстановления красителя. Для повышения специфической активности реагента, связывающего супероксидрадикалы, в смесь дополнительно вводят ионы двухвалентного цинка в зквимолярном соотношений. 1 з.п. ф-лы, 4 табл.

1352327

Изобретение относится к биологи- ческой химии и может быть использовано в биохимии и медицине для определения генерации супероксидных ра5 дикалов химическими и биологическими системами.

Цель предложения — упрощение способа достигается за счет использования в качестве специфического пе- 10 рехватчика супероксидных анионов эквимолярной смеси карнозина (р-аланил-o(-гистидина) и ионов двухвалентной меди в конечной концентрации

1-1 0 мМ. С целью повышения специфи- 15 ческой активности перехватчика в смесь дополнительно вводят ионы двухвалентного цинка в эквимолярном с соотношении.

Пример 1. Определение спе- 20 цифической супероксидперехватывающей активности карнозина в присутствии ионов двухвалентной меди и двухвалентного цинка.

Определение проводили в двух системах, генерирующих супероксидные радикалы.

Система 1. В кювет спектофотометра вносили 1,7 мл 100 мМ фосфатного буфера, .рН 8,3, 0,2 мл НАДН (0,7 мг/мл),30

0,3 мл феназинметасульфата (2,3 мг/мл) .и 1 мл нитросинего тетразолиевого (4,8 мг/мл). Записывали изменение оптической плотности при 560 нм на спектрофотометре в течение 1,5 мин.

Возрастание оптической плотности, характеризующее скорость восстановления красителя, происходило линейно.

На основании этой скорости определяют скорость генерации супероксидных анион-радикалов. В качестве красителя можно также использовать феррицитохром с регистрацией оптической плотности при 550 нм.

Система II. В кювету спектрофото- 45 метра вносили 0,2 мл ксантина (2 мг/мл), 2,7 мл натрий- карбонатного буфера, 75 мИ, рН 10,2, содержащего

1,5х10 М ЭДТА, 0,2 мл раствора ксантиноксидазы и 0,2 мл нитросинего

50 тетразолия (18 мг/мл), Возрастание оптической плотности при 560 нм происходило линейно в, течение 1,5-2 мин.

В качестве красителя можно использовать ферроцитохром с регистрацией оптической плотности при 550 нм, Для подтверждения генерации этими системами именно супероксидных радикалов в кюветы добавляли суперокТаблица 1

Концентрация кар- Степень ингибированозина и CuSO ния восстановления, (конечная), мИ нитросинего, Х

i 0

2,5

5 0

7,5

70

10,0

15,0

Из табл. 1 видно, что кариозны в присутствии CuSO< в зависимости от концентрации осуществляет перехват супероксидных радикалов, ингибируя восстановление красителя. Специфичность перехвата подтверждена отсутсипдисмутазу в различных разведени- ях, подбирая разведения таким образом, чтобы в пробе присутствовала

1 ед. активности фермента, т.е. то количество фермента, которое тормозит восстановления красителя в 2 раза. Рассчитать исходно это количество фермента исходя из концентрации белка невозможно в связи с различной удельной активностью разных препаратов супероксиддисмутазы и изменением удельной активности в процессе хранения.

Готовили 100 мИ раствор карнозина, содержащий 100 мИ CuSO, а также

100 мМ раствор карнозина, содержащий

100 мМ CuSO и 100 мМ ZnSO . Проводили определение скорости генерации супероксидных анион-радикалов с использованием систем I u II. Концентрация ингредиентов системы подобраны таким образом, чтобы скорость восстановления в отсутствие перехватчика составляла 0,1 ед. оптической плотности 10 с в обеих системах..

В табл. 1 представлена зависимость степени ингибирования восстановления нитросинего тетразолия (эта зависимость не различалась в системах

I и II) от концентрации карнозина и Cuso,.

3 135232 ствием взаимодействия с другими радикалами кислорода (перекисью водорода в системе окисления скополетина, гидроксильными радикалами). Использование концентраций перехватчика ниже 1 мИ нецелесообразно, поскольку степень ингибирования незначительна.

В связи с тем, что ошибка измерения сильно возрастает при превьппении 10 степени ингибирования 70Х, нецелесообразно также использовать концентрации выше 10 мМ.

В табл. 2 представлена зависимосТь степени ингибирования от концентрации 15 карнозина в присутствии CuSO и ZnSO .

Т а б л и ц а 2

Степень ингибирования восстановления нитросинего, Х.Концентрация карноэина, CuSOf H

Еп$0 (конечная), мИ

35

0,25

0 5

50

1,0

2,5

5 0

35

10,0

100

15,0

Ф

Из табл. 2 видно, что дополнительное введение в смесь ZnSO приводит к существенному повьппению специфической активности перехватчика,.что дает возможность использовать его в значительно более низких концентрациях (ингибирование на 507 в отсутствие Zn$04 достигается при концентрации карнозина и CuSO< 7,5 мМ, а в присутствии Zn$0 при концентрации

1,0 мИ). Перехватывающая активность карнозина в присутствии Zn без Cu + значительно ниже активности карнозина 5 в присутствии Си +. Следует также от метить, что введение в системы Cu + или Zn без карноэина в концентрации до 15 мИ вызывало снижение скорости

4 восстановления красителя. Супероксидперехватывающей активностью обладают комплексы карноэина с медью или медью-цинком (известно, что с этими металлами карноэин образует прочные комплексы). !

Степень ингибирования, представленная в табл. 1 и 2 не зависит от использованного препарата карноэина и соли меди или цинка (сходные данные получены при использовании солянокислых солей меди и цинка; важно, чтобы соль была хорошо растворима, а анион был нейтральным — не взаимодействовал с системой генерации суперокси- . да) .

Таким образом, использование в качестве перехватчика супероксидных радикалов карнозина в присутствии ионов двухвалентной меди или цинка вместо супероксиддисмутаэы позволяет упростить способ определения супероксидных радикалов за счет отсутствия необходимости подбора концентрации перехватчика в каждой серии экспериментов, а также использования стабиль ных растворов перехватчика с неизменной специфической активностью.

Пример 2. Определение супер.. оксидных анион-радикалов в биологических объектах, А. Определение генерации супероксидных радикалов лейкоцитами.

Из крови крыс дифференциальным центрифугированием получают фракцию лейкоцитов, суспендируют в среде

Хенкса и в разных разведениях вносят в кювету спектрофотометра, содержащую среду Хенкса и нитросиний тетраэолий, подбирая такое разведение клеток, чтобы скорость нарастания оптической плотности при 560 нм была линейна по крайней мере в течение 1,52 мин, а скорость прироста оптической плотности составляла О, 1+0,03 ед. оптической плотности 10 с. В пробы с подобранной концентрацией клеток вносят различные концентрации карнозина в присутствии ионов меди или меди+цинка и определяют ингибирование скорости генерации радикалов.

Для сравнения вносят супероксиддисмутаэу, концентрацию которой предварительно подбирают в одной из моде цьных систем генерации супероксидных радикалов (см. пример.1, системы

Т и ТТ). Полученные данные представлены в табл. 3.

5 1352327

Таблица 3

Таблица 4

Степень ингибирования скоРости восстановСтепень ингибирования скоПерехватчик

Перехватчик рости восстановления вления проба 1 проба 2

0%

0% 07.

40%

Ñu-карнозин, 7,5 мМ 307. 25Х

15 Си-карноэин, 10 мМ 65Х 50%

757.

407

Cu, Zn-карнозин, 1 мИ 30% 257, 80%

20 Cu Zn-карноэин, 10 М 70% 60Х

40Х

307. 27Х

70% 60Х

СОД, 1 .ед.

СОД, 10 ед.

70%

80Х

Из данных табл, 3 видно, что большая часть радикалов, восстанавливающих нитросиний тетразолий, является супероксидными радикалами, так как на 80Х-ное восстановление ингибируется супероксиддисмутазой (СОД).

Видно также, что использование в качестве перехватчика карнозина в присутствии меди или цинка не 35 уступает прототипу по специфичности.

Б. Определение супероксидных анион-радикалов в спинно-мозговой жидкости, Определение проводили в пробах спинно-мозговой жидкости кролика (1) и человека (2), взятых при помощи пункции. Подбирали разведение проб таким образом, чтобы скорость восстановления нитросинего была оптимальна (см. пример А) и на оптимальной концентрации спинномозговой жидкости в кювете спектрофотометра регистрировали скорость изменения оптической плотности в присутствии перехватчиков (табл. 4).

Из данных табл. 4 видно, что в пробе 1 — 70%, а в пробе 2 — 60% скорости восстановления нитросинего тетразолия ингибируется специфическими перехватчиками, значит именно эта часть приходится на долю генерации супероксидных анион-радикалов.

1. Способ определения супероксидных анион-радикалов путем добавления в систему генерации радикалов красителя и реагента, обладающего свойст» вом связывать супероксид-радикалы, с последующей инкубацией, спектрофотометрией и определением результата по величине снижения скорости восстановления красителя, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве реагента используют эквимолярную смесь карнозина и ионов двухвалентной меди в конечной концентрации 1-10 мИ.

2, Способ по п. 1, о т л и ч а— ю шийся тем, что, с целью повышения активности реагента, в.смесь дополнительно вводят ионы двухвалентного цинкапри эквимолярном соотношении корнозина, ионов цинка и ионов меди.

Си-карнозин, 7,5 мМ

Си-карнозин, 10 мМ

Cu, Zn-карнозин, 1 мМ

Cu, Zn-карнозин, 10 мИ

СОД, 1 ед

СОД, 2 ед

СОД, 10 ед

Примеры показывают, что замена супероксиддисмутазы на карнозин в присутствии ионов меди и цинка не приводит к снижению специфичности, точности и чувствительности способа, обеспечивая при этом его упрощение.

Формула изобретения