Способ получения конъюгированного соединения,специфичного по отношению к клеткам меланомы

 

Изобретение относится к области медицины и может найти применение при получении соединений, ингибирующих рост и развитр4е меланом. Целью изобретения является повышение терапевтической активности препарата. Для получения конъюгированного соединения комплексируют цепочку А Рицина (р) с антителом к меланоме человека (AT). Р обладает цитотоксической активностью, AT способно селективно распознавать антиген раковых клеток. Перед конъюгацией AT обрабатывают 3-(2-пиридилдисульфанил)- пропионовой кислотой в буферном растворе в присутствии карбодиимида. Обработку проводят в течение 20 ч при температуре . Модифицированные таким образом AT конъюгируют с Р в течение 20 ч при температуре . Полученное соединение очищают от примесей традиционньгм способом. Соединение обладает значительной специфичностью действия по отношению к клеткам меланомы и безвредно для здоровых клеток. Цитотоксическая активность соединения в 400 раз выше , чем Цитотоксическая активность Р. с S СО со sD со а см

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 А 61 К 39 44

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К flATEHTV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3427002/28-13 (22) 14,04.82 (31) 8107596 (32) 15.04.8! (33) FR (46) 07.08.87.Бюл. У 29 (71)Санофи (FR) (72) Франц Клаус Янсен и Пьер Грос (FR) (53) 615.45:616.98 (088,8) (56) Proceedings of the National

Academy of Saences of the USA, 1980, 77(4), р.2183-2187.

JoUrnal of Biological Chem, 1974 (11), р.3557-3562.

Заявка Франции У 2437213, кл. А 61 К 39/395, 1980.

Заявка Франции У 2466252, кл. А 61 К 39/395, 1980. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГИРОВАННОГО СОЕДИНЕНИЯ, СПЕЦИФИЧНОГО ПО

ОТНО!!1ЕНИЮ К КЛЕТКАМ МЕЛАНО!Ф1 (57) Изобретение относится к области, медицины и может найти применение при получении соединений, ингибирую„„SU „„1329604 А 3 щих рост и развитие меланом. Целью изобретения является повышение терапевтической активности препарата.

Для получения конъюгированного соединения комплексируют цепочку А Рицина (P) с антителом к меланоме человека (АТ). Р обладает цитотоксической активностью, АТ способно селективно распознавать антиген раковых клеток. Перед конъюгацией AT обрабатывают 3-(2-пиридилдисульфанил)пропионовой кислотой в буферном растворе в присутствии карбодиимида.

Обработку проводят в течение 20 ч при температуре 30 С. Модифицированные таким образом AT конъюгируют с

P в течение 20 ч при температуре

25 С. Полученное соединение очищают от примесей традиционным способом.

Соединение обладает значительной специфичностью действия по отношению к клеткам меланомы и безвредно для здоровых клеток. Цитотоксическая активность соединения в 400 раз выше, чем цитотоксическая активность P.

1329604

Л

Получают сырой раствор, содержащий протеины. Очищают полученный раствор абсорбционной хроматографией на колонке иэ Сефароэы, уравновешенной буфером TRIS-НСI, 10 мМ, рН 7,7, охлажденным до 4 С. Элюенты: буфер

TRIS-НС1, 10 мМ,рН 7,7, и этот же буфер в смеси с галактозой.

Очищенный раствор Рицина концентрируют ультрафильтрацией на пористой мембране. Получают чистый раствор Рицина в буфере.

Для выделения цепочки А Рицина очищенный раствор обрабатывают восстановителем, например 2-меркаптоэтанолом на колонке с ионообменной полисахариднэй матрицей, например, ДЕАЕ

Сефароэы 6В, уравновешенной буфером TRIS-HC1, 0,1 М, рН 8,4, содержащем упомянутый восстановитель. Две цепочки А и В рицина фиксируются на колонке эа счет онной связи с группами ДАЕА, а цепочка В фиксируется также эа счет сродства к матрице Се— фарозы.

Элюирование цепочки А осуществляют буфером TRIS-HCI, 0,1 M, pH 8,4, содержащим NaCI 0,1 М и 2-меркаптоэтанол с концентрацией 2,57. Получают фракцию, содержащую цепочку

А Рицина, идентифицированную электрофорезом. Эту фракцию диализируют на колонке с карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенной фосфатным буфером

10 мМ, рН 6,5, мол.м.полученной цепочки А Рицина = 30000 3000; изоэлектрическая точка: 7,5.

Для модиАикации антитела антимеланомы к 0 5 мл раствора, содержащего

20 мг/мл 3-(2-пиридилдисульфанил )пропионовой кислоты в третичном бутаноле, прибавляют 0,2 мл раствора, содержащего 60 мг/мл 1-этил-3-(3-диметиламинпропил,1-карбодиимида, и оставляют смесь на 3 мин при температуре окружающей среды.

30 мл полученного таким образом раствора прибавляют к 1,66 мл раствора антитела антимеланома, содержащегося в количестве 2,4 мг/мл в буферном растворе PBS. Инкубационный период составляет 20 ч при 30 С.

Затем непрерывно осуществляют диализ раствора в течение 3 ч против

21 л буферного раствора PBS при температуре 4 С. Таким образом получают 4 мг активированного антитела при концентрации 2,3 мг/мл.

С помощью спектройотометрического анализа по длине волны 343 нм освобожденного 2-тионпиридина с исполь- . зованием восстановленного глютатиона устанавливают, что получено антитело, несущее 2,6 групп-активаторов на моль антитела.

Для получения конъюгированного соединения к 1,3 мл раствора активированного антитела в буферном растворе РВВ (концентрация 2,3 мг/мл или

3 мг активированного антитела прибавляют 0,52 мл раствора цепочки

А Рицина, взятой в том же самом буферном растворе (концентрация

5,8 мг/мл). Инкубируют в течение

20 ч при 25 С, Реакционную смесь подвергают хроматографии на колонке с гелем Sephadex С 100. В каждой фракции определяют концентрацию антитела с помощью спектрофотометрии на длине волны 280 нм и концентрацию цепочки А по ее ингибиторной способности по отношению к протеосинтезу, измеренную на клеточной системе. Идентичные фракции, содержащие конъюгированное соединение, объединяют и получают таким образом примерно

1 мг соединения с концентрацией

0,2 мл/мг.

Осуществленный анализ позволил выявить, что раствор содержит

50 мг/мл биологически активной цепочки А или примерно 1,4 моля цепочки

А на моль антитела.

Исследование, осуществленное с помощью цитофторометрии, помимо того, позволило выявить, что использованное антитело антимеланома, соответствукицее активир,званное антитело и конъюгированное соединение этого антитела с цепочкой А Рицина составляют очень близкие гистограммы флуоресценции. Это свидетельствует о том, что антитело не испытывает никакого значительного изменения в течение реакций активаций и соединений, которым оно было подвергнуто, в частности что оно остается способным, даже находясь в общем соединении, распознать антиген P 97, про" тив которого оно и направлено.

Пример 2. Полученное соединение исследуют в отношении его антиракового действия.

Определение ингибирования протеосинтеза.

1329604

Основным биологическим свойством цепочки А Рицина является ингибирование (торможение 1 клеточного протеосинтеза с помощью изменения субьединицы рибоэомаля 60 5

Используя модель клетки, определяют зфг!Зект изучаемых веществ на внедрение Г С-лейпина в клетки, пораженные культурой рака °

Используемые клетки принадлежат к клеточному потомству М.1477, полученному из меланомы человека, имеющую антиген P 97. Эти клетки после трипсинации подвергают предварительной инкубации в течение по меньшей мере 24 ч с тем, чтобы допустить новое проявление поверхностных антигенсB когсрые возможно изменились.

После присоединения изучаемого вещесгва осуществляют новую инкубацию.

По окончании инкубации приступаю7 к измеренн1о cтепени включения "4 C-лейц1гна обработанным -аким образом клетками.

Это изменение проводят в соотвеTc TBHH c; Âé!I!ö,-1онной методикой, используя индикатор 4С-лейцина

;,-гя определения сгепенн протеосинтеза. Определение голученной радиоак7 ив но 1 I I o" уще Tb Jiяю г в данном слу

30 1ае на ц: л 1х изолированных ф 1льтраваннем кле-:ках.

По окончании зтнх определений строят гр,3ьн1 зависимости эффекта от дозы (!7!7 абс !Icсе aткладывают концентрацию нзу-3аемьгх веществ, а по ординате откладывают внедрение

14

С-лей Зина, выраженное в процснтах .-тО От!Oirie!I IO г ВН7:ДРЕНИЮ В СРаВНИВаЕмыа кле кг1 пр1! отсутствии изучаемого в"-ществ; ).

Из г рафик а;,;ределя1от для Ia».— дого изу-.;:емого вещеc7"âà концентрацию, 11рн кот=рой происходит 507. внед4 С п,йц.1н.

14 концентрация 50,С1 50) .

В результате определения установлено, что !1 .-;;.ен1 о-. ко гьюгированное

=оединенне обл;,,,гьт ".1ль11о,"1 цитоксичной акт Ii-i.!acr!!o y,..i 50 =- 5 10 М), т. е. прв1=рнo в -400 раз более значительной, чем цитоксичная активность цепочки А Рицнна.

Тормо3кенне обра:3ования колоний.

Клетки с куль-;урой меланома

М 1477 отк-1еи33ают от нх подложки с помощью расгвора 17егвепе (буферный раствор РГ5, содержащий этилендиа3.1ннгетрауксусную кислоту ) или с помощью трипсинизации. Этими клетками за— севают (из расчета 2 10 клеток на чашку Петри, имеющую диаметр 5 см ) среду следующего состава: среда

РРМ1 1640 (Mericux) с добавкой глутамина 2 мМ, бикарбонат натрия 2 г/л, 15K инактивированной зародышевой сыворотки теленка (Sегоmed) и антибиотика пеницилин, стрептомицин и амфотерицин R ).

Через 24 ч клетки обрабатывают различными концентрациями полученного по примеру 1 соединения.

3!ля сравнения аналогичную серию экспериментов проводят с Рицином, с цепочкой А Рицина и с неспецифичным конъюгированным соединением этого клеточного потомства (общим с цепочкой А Рицина и антителом анти-DNP/PS 10) °

По истечении,24 ч среду культуры удаляют и заменяют на такую же свежую среду без какой-либо цитотоксичной субстанции.

Через 10-15 дней число развившихся колоний определяют по окраске с помог1ью раствора фиолетового кристалла н пвтомстического счетчика коло-!

3IIrI (СИСтЕМа АртЕК 880).

Э.ror метод позволяет обнаружить гакие низкие количества, как 10 жизне- способных клеток на чашку, а также осуществить проверку, используя контропьные культуры. Таким образом выявлено, что образование колоний строго пропорционально начальной конп1 нтрации клеток, по меньшей мере в пределе от 10 до 10" клеток на мл.

R результате эксперимента установ— лено, что по.пученное коньюгированное соединение обладает высокой активностью, так как последняя клетка мелано 1а убита при концентрации, приблизительно равной ? 10 l"1 общего соединения. Эта концентрация совершенно сг3авннма с концентрацией

Рицина (1 )О 4), тогда как для цепочки А Рицина необходима концент— рация 10 М для достижения аналогичного эффекта.

Ко13ъюгированное соединение совершенно нс проявляет активности при кон11енrpai!14v ниже 2 .10 8 М, Результаты этого эксперимента полностью подтверждают результаты, по1329604 подвергают взаимодействию с цепочкой А Рицина °

Составитель В.Романова

Редактор А.Ворович Техред М.Ходанич Корректор М. 1ароши

Заказ 3498/58 Тираж 595 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r.Óæãîðîä, ул. Проектная, 4 лученные при исследовании торможения протеосинтеэа, Таким образом, соединения, полученные согласно изобретению, облада5 ют значительной специфичностью действия по отношению к клеточному потомству меланомы человека. Эти соединения могут быть использованы при лечении меланом человека и возможно 1ð других раковых заболеваний, которые подвергаются воздействию испольэуемого антитела.

Эти конъюгированные соединения определены для использования в виде 15 инъекций. Они могут применяться либо отдельно, либо в сочетании с другими лекарствами, показанными для раковых заболеваний, и, в частности, в сочетании с другими иммуноподавляю- 20 щими медикаментами для замедления и ослабления естественной иммунной реакции пацинента в отношении посторонних веществ в его организме, которыми являются конъюгированные соеди- 25 нения.

Ставя целью полностью удалить раковые клетки, лечение должно осуществляться при использовании достаточной дозы конъюгированного вещества, а продолжительность лечения должна быть определена в каждом отдельном случае в зависимости от причины и природы иэвлечиваемого заболевания. формулаизобретения

Способ получения конъюгированного соединения, специфичного по отношению к клеткам меланомы, о т л и " ч а ю шийся тем, что, с целью повышения терапевтической активности препарата, антитела к меланоме, обработанные в присутствии водорастворимого карбодиимида соединение формулы