Способ разделения мононуклеарных фагоцитов на субпопуляции

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии и цитологии. Цель изобретения - повышение качества препарата. Получают суспензию клеток перитонеального экссудата от интактныхмьшей. На культуральньгх чашках, покрытых альбумином, производят адгезию полученных клеток в среде 199 с HEPES-буфером. Неприлипшие клетки переносят на другие чашки, покрытые альбумином в концентрации 1 мг/мл, адгезируют полученные клетки. Затем неприлипшие клетки переносят на третьи чашки, покрытие альбумином в концентрации 2 мг/мп, и адгезируют . Все три чашки инкубируют с сывороткой Рогатого скота и чашки отмывают до лимфоцитов. Во всех трех чашках определяют число клеток, интенсивность фагоцитоза и секрецию лизоцима. По количеству клеток в различных, чашках вьщеляют популяции секретирующих клеток, неактивных и фагоцитирующих клеток. 2 табл. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU, 1307284 (50 4 G 01 N 1/28 с

:Ц

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3866195/28-14 (22) 13.03.85 (46) 30.04.87. Бюл. № 16 (71} Институт иммунологии (72) В.И. Пантин, А.О. Фрейвальд, С.В. Родионов и А.М. Сапожников (53) 616-0.88.8(088.8) (56) Cambell et al. All of Immunoloey, 1978, ч. 38, р ° 94 †1.

Авторское свидетельство СССР

¹ 1179223, кл. G 01 N 1/28, 1983. (54) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ МОНОНУКЛЕАРНЫХ ФАГОЦИТОВ НА СУБПОПУЛЯЦИИ (57) Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии и цитологии. Цель изобретения — повышение качества препарата. Получают суспензию клеток перитонеального экссудата от интактных мышей. На культуральных чашках, покрытых альбумином, производят адгезию полученных клеток в среде 199 с HEpES-буфером. Неприлипшие клетки переносят на другие чашки, покрытые альбумином в концентрации 1 мг/мл, адгезируют полученные клетки. Затем неприлипшие клетки переносят на третьи чашки, покрытие альбумином в концентрации 2 мг/мл, и адгезируют. Все три чашки инкубируют с сывороткой рогатого скота и чашки отмывают до лимфоцитов. Во всех трех чашках определяют число клеток, интенсивность фагоцитоза и секрецию лиэоцима.

По количеству клеток в различных.чашках выделяют популяции секретирующих клеток, неактивных и фагоцитирующих клеток. 2 табл.

1307284

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунопогии и цитологии.

Целью изобретения является повышение качества препарата за счет того, что исходную суспензию клеток после- 5 .довательно инкубируют на полистироловых чашках, предварительно обработанных альбумином, и инкубирование проводят прй рН среды 7,0-7,1 в градиенте концентраций альбумина 0,1 в 2 мг/мл о. при 12 ., либо в градиенте температуры 12, 20, 37 С при концентрации альбумина 2 мг/мл, причем субпопуляции мононуклеарных фагоцитов (МНФ) полу— чают в виде монослоя.

Пример 1. Разделение резидентных перитонеальных макрофагов.

Получают суспензию клеток перитонеального экссудата от 20 — 25 интактных мышей самцов линии F (ÑÂÀ «

«С57В?,) весом 20-25 г. На культуральных чашках из полистирола, предварительно покрытых альбумином (концентрация альбумина в среде прединкубации чашек 2 мг/мл), производят адгеэию полученных клеток в культуральной среде 199 с 10 мМ НЕРЕ$ буфера при а рН 7,0 при 12 С в течение 30 мин. За- 0 тем неприлипшие клетки переносят на другие чашки, предварительно покрытые альбумином в более низкой концен— о трации (1 мг/мл) для адгезии при 12 С в течение 30 мин . Затем суспензию

35 клеток, не прилипших при концентрации альбумина 1 мг/мл, переносят на новые чашки, покрытые альбумином, в концентрации 0,1 мг/мл, и проводят адгезию также при 12 С в течение 30 мин. о

На последнем этапе все полученные в виде монослоев субпопуляции инкуби— о руют (37 С) с 57.-ной сывороткой рогатого скота и тщательно отмывают для удаления лимфоцитов. Для каждой из субпопуляций перитонеальных макрофагов определяют следующие показатели: число клеток, интенсивность фаго- . цитоэа опсонизированных эритроцитов барана (ЭБ) через Fc-рецепторы одно50

ro из ключевых способов фагоцитоза и элиминирования макрофагами чужеродных объектов, бактерий и др.; секрецию лизоцима, разрушающего клеточные стенки бактерий, обеспечивающего бактерицидную активность сыворотки крови, секрецию P — галактозидазы, одного из ключевых лизоСомальных фер— ментов, участвующих в переваривании и лизисе микроорганизмов. Полученные данные представлены в табл. 1.

Пример 2. Разделение перитонеальных макрофагов.

Получают суспензию клеток перитонеального экссудата от 20-25 интактных мышей. На культуральных чашках из полистирола, предварительно покрытых альбумином в концентрации

0,1 мг/мл, производят адгезию полученных клеток в среде 199 с 11 мМ

HEPES буфера при рН 7,1 при 12 С в течение 30 мин. Затем неприлипшие клетки переносят на другие чашки, предварительно покрытые альбумином в концентрации 1 мг/мл, производят ад) гезию полученных клеток в среде 199 с 11 мМ HEPES буфера при рН 7, l при о

12 С в течение 30 мин. Затем неприлипшие клетки переносят на третьи чашки, предварительно покрытые альбумином в концентрации 2 мг/мл, производят адгезию. Далее все три чашо ки инкубируют при 37 С с 5Х-ной сывороткой рогатого скота, после чего чашки отмывают от лимфоцитов. Во всех трех чашках определяют число клеток, интенсивность фагоцитоза, секрецию лизоцима и по количеству клеток в чашке с 0,1 мл/мл альбумина выделяют популяцию секретирующих клеток, а по количеству клеток в чашке с 1 мл/мл альбумина выделяют нов пуляцию неактивных клеток, а в чашке с 2 мг/мл выделяют популяцию фагоци— тирующих клеток (см. табл.1).

В табл. 2 дано сравнение различий по биохимическим параметрам между фракциями, полученными по известному и предложенному способам.

Сравнительные данные табл. 2 свидетельствуют об улучшении разделения по биохимическим параметрам, т.е. о большей чистоте получаемых субпопуляций.

Формула и з о б р е т е н и я

Способ разделения мононуклеарных фагоцитов на субпопуляции путем инкубации в среде 199 на белковом суб- . страте с последующим учетом клеток, отличающийся тем, что,с целью повышения качества препарата при разделении клеток на фагоцитирующие, неактивные и секретирующие фагоциты, среда дополнительно содержит

1307284 4 ем концентрации альбумина от 0,1 до

2 Mr/ìë, при концентрации альбумина

0,1 мг/мл выделяют популяцию секретирующих клеток, а при концентрации альбумина 1 мг/мл выделяют популяцию неактивных клеток и при концентрации альбумина 2 мг/мл вьщеляют популяцию фагоцитирующих клеток.

Таблица 1

HEPES-буфер рН 7,0-7,1 при следующих соотношениях, компонентов, мас.X:

HEPES-буфер 10-1 1

Среда t 99 Остальное

5 а в качестве белкового субстрата используют альбумин, при этом инкуба— цию проводят с постепенным увеличениКонцентрация Фагоциты, Интенсивность Интенсивность Выделенные альбумина, 7 фагоцитов секреции популяции мг/мл

0,6+ 0,1

29 и l4

1,2 + 0,8

0,1

Секретирующие клетки

19+ 8

0,5+ 0,2

0,6 0,4

Неактивные клетки

52 12

2,3+ 0,6

0,2+ 0,1

Фагоцитирующие клетки

Таблица 2

Активность лактат- Активность цитодегидрогеназы, хромоксидазы, мФЕ/10 МНФ мФЕ/10 МНФ

Субпопуляция, Ф (С) Активность глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, мФЕ/10 МНФ

Известный способ (разделение на ФТС) 1 (4) 1,17/0,60=

1,9 раэ

60, 91/14, 5=

4,2 раэ

4,88/1,98= — 2,4 раэ

Предлагаемый способ (разделение на альбумин) Пример 1 (t 12 С) 1(2 мг/мл . альбумина) 5,77 12,92

1,16k 0,18

0,88 0,32

2(1 мг/мл альбумина) 0,25+ 0,09

62,25 + 4,18

5,24 1 0,68

3(0, 1 мг/мп альбумина) 28,40 2 6,56

0,53 + 0,12

2,62 0,87

2 (10)

3 (28)

4 (37)

Максимальные различия:

32,23 + 1,47

14,50 3 1,51

36,65 6 22, 1О

60,91 Е 1,48

0,89 1 0,06

1,17+ 0,05

0,70 0,03

0,60+ 0,02

3,16+ 0,57

1,98 + 0,48

2,66 0,77

4,88 + 0,61

1307284

Пр л<.тжсние табл.2

Максимальные различия

5,24/0 88=

6,0 раз

1, 16/О, 25= — 4,6 раз

62,25/5,77=

10,8 раз

Пример 2 (концентрация альбумина

2 мг/мл) 5,77+ 2,92 (12) 25,05+ 5,76

73,89ь 8,45

Максимальные различия. 5,57/0,88=

= 6,3 раз

1,16/0,20=

5,8 раз

73,89/5,77=

12,8 раз

Составитель M. Позняк

Техред В. Кадар Корректор А. Обручар

Редактор Н. Швьщкая

Заказ 1622/40

Тираж 777

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

2 (20)

3 (37) (2

1,16 0,18

0,45+ 0,08

0,20+ 0,12

0,88+ 0,32

2,76+ 0,56

5,57 0,95