Способ получения антибиотика 76- @

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА 76-11, предусматривающий культивирование штамма Actinomadura Sp 76-11 FERM ВР 83 при аэрации на водной питательной среде, содержащей 3% овсяной муки, 1,5% глицерина и 0,5% мясного экстракта, удаление выращенных клеток, выделение антибиотика из культуральной жидкости зтилацетатом с последующей очисткой его методом хроматографии на силикагеле с элюцией антибиотика смесью, состоящей из 50% бензола и 50% этилацетата.

СВОЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИДЛИСтИЧЕСНИХ

1 ЕСТ ЛИН

Л0 12762

А3 (50 4 С 1Z N 1/10

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, :

Н flATEHTV (21) 3478751/30-15 (22) 03.08.82 (31) 122210/1981 (32) 04.08.81 (33) (,ХР) (46) 07. 12.86. Бюл. ¹ 45 (71) Рикагаку Кенкюсе, Какен Кемикап

Ко, Лтд (JP) (72) Киоси Исоно, Гото Накамура и Сиi ео Фудзита (JP) (53) 615.779.93 1(088.8) (56) Diagnosis and treatment of

fungal infection. Ed, by Н. Robinson. — Springfield: Thomas, 1974. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИ—

КА 76-11, предусматривающий культивирование штамма Actinomadura Sp

76 — 11 FERM BP 83 при аэрации на водной питательной среде, содержащей

37 овсяной муки, 1,57 глицерина и

0,57 мясного экстракта, удаление выращенных клеток, выделение антибиотика из культуральной жидкости этилацетатом с последующей очисткой его методом хроматографии на силикагеле с элюцией антибиотика смесью, состоящей из 507. бенэола и 50Х этилацетата.

1276248

25

Физиологические характеристики.

Штамм хорошо растет при 33-37 С, слегка разжижает желатин, свертывает и пептонизирует снятое молоко и не образует меланинового пигмента.

Изобретение относится к способам получения антибиотиков.

Целью изобретения является способ создания высокоэффективного антикокцидиоидозного препарата. 5

Используемый микроорганизм принадлежит к роду Actinomadura, штамм

Sp. 76-11 и способен продуцировать антибиотик 76- II. Штамм Sp 76- 11 хранится в Институте ферментационньи исследований Ведомства по промышленной науке и технике Министерства международной торговли и промышленности (FERM). Штамму присвоен номер FERM

BP-83. 15

Характеристики штамма Sp 76-II на различных культуральных средах наблюдают через 20-30 дней после инокуляции: а-Арабиноза. хороший рост

D-Ксилоза

D-Ãëþêîçà

D-Фруктоза

Сахароза

L -Инозит рост есть е -Рамноза хороший рост

Рафиноза. рост есть

Маннит очень хороший рост

Штамм Sp 76-11 может быть охарак- 30 теризован следующими признаками.

Морфологические признаки.

Sp 76-IT., как правило, не образует воздушный мицелий, но иногда образует его по прошествии длительного перно- 35 да культивации. Субстратный мицелий является изогнутым, и в последний период культивации делится с образованием эллиптических спор. Мицелий грамположительный и кислотостойкий. 40

Рост на различных средах.

Бр „76 † не растет или плохо растет на различных агарах, но агар с овсяной мукой и агар с дрожжевым экстрактом и солодовым экстрактом яв- 45 ляются для него хорошей культуральной средой.

Штамм лучше растет на агаре с овсяной мукой и образует голубоватоиндигоидный, нерастворимый в воде пигмент в клетках по прошествии 3А недель культивации.

Использование сахяpОВ.

Штамм хорошо использует о(,-арабиD KcHlIo3y D-rveKo3y» D-фрук тозу, сахарозу, F-инозит,сб -рамнозу. рафинозу и маннит на агаре Придхэма и Готлиба в качестве культуральной среды, к которому добавлено 0,17. дрожжевого экстракта.

После проведения культивирования на жидкой среде культуральный бульон центрифугируют для отделения клеток от бульона. Полученный таким путем антибиотик 76-11 может быть выделен из культуральной среды любым общепринятым методом, который обычно используется для выделения метаболита. Например, можно применить метод, использующий различие в растворимости между антибиотиком 76-11 и примесью, или метод, использующий адсорбционное сродство между ними, или их комбинации.

Выработанный антибиотик 76-11 присутствует как в культуральном бульоне, так и в клетках, и может быть экстрагирован из культурального бульона с использованием этил- или бутилацетатов, хлороформа, бутанола и т.п., в зависимости от их растворимости. Клетки экстрагируют водным ацетоном или водным метанолом, органический растворитель отгоняют при пониженном давлении, и полученный таким путем водный раствор экстрагируют этилацетатом и т.п. Экстрагированные растворы комбинируют и кон-.. центрируют с получением сырого экстракта антибиотика 76 — 1 1. Поскольку сырой экстракт содержит большое количество примесей, его подвергают адсорбционной хроматографии с использованием силикагеля, окиси алюминия и т.п., а затем очищают. Например, 3 сырой экстракт, растворенный в небольшом количестве бензола, вводят в колонку с силикагелем, предварительно кондиционированную бензолом.

Элюирование проводят с использованием бензола, а затем смесью растворителей бензол — этилацетат, в которой содержание этилацетата постепенно возрастает. Элюат фракциониру— ют с применением коллектора фракций.

Собирают фракции, проявляющие биологическую активность, и концентрируют их с получением очищенного порошка.

Для дальнейшей очистки повторяют аналогичную процедуру хроматографии на з 1 276 силикагеле. Последующую очистку проводят с применением преперативной тонкослойной хроматографии, если это необходимо. Концентрирование при пониженном давлении дает очищенный продукт, который затем растворяют в небольшом количестве метанола и охлаждают, причем антибиотик 76-)1 выделяется в виде бесцветных кристаллов.

Кристаллы отделяют фильтрованием и 10 сушат с получением чистого антибиоти-. ка 76-И. Полученный таким путем антибиотик

76-11 характеризуется следующими физико-химическими и биологическими 15 свойствами.

Элементный анализ.

Свободная кислота, X: С 62,61;

Н 8,27; Ы О.

Натриевая соль, 7: С 60,57; gp . Н 8,04; N О.

Мол. масса: 843 (измерено методом

t титрования); 873 (измерено FD-массспектральным методом).

Т. пл.: свободная кислота 108- 25

112 С; натриевая соль 210-212 С

„о d (с разл.).

Удельное вращение: faLg +36,6 (С=

=0,382 в хлороформном растворе).

Спектр УФ-поглощения. Полосы максимального .поглощения в МеОН и НС1Me0H: щ<„„, =217 мкм (Е, 303)

262 мкм (EÄ, 1 2; 301 мкм (Е„ 68) .

В щелочном МеОН: %макс =260 мкм

1 ; 308 мкм (Е (с,"м50) ° ..

Основные специфические полосы

ИК-поглощения (таблетка KBr).

Свободная кислота: 3450, 2960, 1720, 1640, 1610, 1578, 1446, 1380, 4(1035, 975, 940.

Натриевая соль: 3390, 2960, 17 18, 1640, 1609, 1578, 1450, 1380, 1340, 13 16, 1250, 1197, 1152, 1108, 1092, 1060, 1040, 1002, 980, 930.

Растворимость в растворителях.

Легкорастворим в бензоле, хлороформе, этилацетате и ацетоне, растворим в метаноле, этаноле и диметилформамиде, слаборастворим в воде и гексане.

Реакции окрашивания.

Положительно — на калийперманганатную реакцию, но отрицательно на периодатнокислотно-бензидиновую реакцию. 55

Щелочность, кислотность или нейтральность: кислотное вещество, рКа 4,6 (в 66,77.-ном диоксане).

248

Подопытные микроорганизмы

Минимальная концентрация для подавления роста, мкг/мп

Staphylococcus

aureus 209 P

0,4

Staphylococcus

aureus (multi

resistant) 0,4

Васillus subtilis PC 1219

0,4

Bacillus subtilis Н 17

0,4

Bacillus subtilis ш 45 (rec-) 0,4

0,4

0,4

МусоЬас ter ium

Sp 607

Mycobacterium

phlei

0,4

Мус obacter1цтп

avium

0,4

Escherichia coli 100

Salmonella

typhimurium

100

Действие на опухолевые клетки.

Антибиотик 76- II проявляет индукцию дифференцирования в отношении клеток лейкемии Френда и клеток миелоидной лейкемии в концентрации 1100 мкм/мл.

Токсичность для мышей.

Абдоминальное введение 50, 100 и 200 мг/кг антибиотика 76-II в виде КМЦ-суспензии показало отсутствие токсичности для мьш ей.

Цвет: бесцветные кристаллы.

Антимикробная активность в виде минимальной концентрации для подавления роста различных микроорганизмов на бульоно-агаровой культуральной среде приведена в таблице.

1276

Hl6!ICTIf. Заказ 6585/59 Тираж 490 Подп и с но е пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Произв.-полигр.

5 !!ри сравнении физико-химических и биологических свойств антибиотика !

6-11 cn c.âîéãòëÿìè известных антибиотиков, антибиотик 76-11 может быгь кляссифицирован как так называемый поли. эфир--ионофорный антибиотик на том основании, что он является кислым веществом, его натриевая соль растворима в масле, он проявляет сильную активность в отношении грам- !р положительных и кислотоустойчивых бактерий, не содержит в своей молекулярной структуре а.зота и т.п. Известные вещества не проявляют таких физико-химических свойств, особенно специфических полос УФ-спектра поглощения, как антибиотик 76 — 11, поэтому последний является новым антибиотиком.

A. tòèáH0òèê 7 6- I 1 получают следую- 2н щим образом. !

1икроорганизм Sp 76-11 (РЕЯМ

ВР-83), предварительно культивированный B скошенной культуре, инокулируют в жидкую культуральную среду, содер- 25 жащую З овсяной муки, 1,5Х глицерина. и 0,5/ мясного экстракта (рН около 6,5), и культивируют при 28 С в течение 11 суток при встряхивании.

Каждые 3 мл культурального раствора 3н инокулируют в свежую культуральную среду, содержащую те же составляющие, и культивируют еще в течение 7 суток.

140 мл кульгурального раствора, полученного таким путем, инокулируют в 18 л культуряльной среды, содержащей те же составляющие в баковом фер— ментаторе, и культивируют при 28 С в течение 210 -T c аэряцией 18 л/мин и перемешиванпем со скоростью 40

3 30 об /мин .

После культивации в культуральный раствор добавляют 400 г диатомита (Радиопит 700), после чего раствор подйергают центробежной фильтрации. 4>

Полученную надосадочную жидкость (14 <„ pH 7,8) дважды экстрагируют 8 и 5 л эTHJIàöåтата с.оответственно, а клетки экстрагируют дважды соответственно 9 и 6 п ацетона. Экстрагированный раствор концентрируют в вакууме с получением Z л водного раствора (рП 8), который затем дважды экстра248 гируют в 1 л этилаие Iÿ rrl, !!о .педний проэкстрагированный этипацетятом раствор смешивают с первым раствором, полученным из нацосадочной жидкости, и концентрируют в вакууме. Полученный таким путем осадок растворяют в небольшом количестве бензола, который вводят в колонку с силикагелем (ф 3 х 50 см), предварительно конди— ционированную бензолом. Элюировяние проводят с использованием 2 л бензо— ла, а затем 1 л смеси бензол-этилацетат (5:1 по объему), 1 л смеси бензол-этилацетат (i: 1 по объему).

Активные фракции элюируют смесью бен— зол-этилацетат (1:1 по объему), собирают, концентрируют в вакууме и обрабатывают метанолом с получением 1 г сырого кристаллического вещества. Несколько перекристаллизяцпй из метанола дают 400 мг чистого кристаллического вещества нятриевой соли антибиотика 76-11.

Далее антибиотик испытывают в качестве антикокцидиоидозного препарата.

Установлено, что цыплята, которым вводят антибиотик /6 †, не проявляют каких-либо симптомов кокиидиоидоза даже после инфицирования, т.е. рост ооцист Eimeri;. сепе1.!я существенно подавляется, следовательно, антибиотик 76- 11 исключительно эффективен как антикокцидиоидозный препарат.

Введение антибиотика .76 † в кон-1 центрации 25 и 50 млн, ускоряет рост на 6,1 и 7,ii соответственно, и повышает эффективность усвоения кормов на 5,9 и 7,47 соответственно.

Введение антибиотика 76-II, полученного согласно предлагаемому способу, травоядным животным ускоряет их рост и повышает эффективность усвоения ими кормов. Кроме того, введение антибиотика 76-11 не только предотвращает раздувание живота или кетоз, часто наблюдающееся у крупного рогатого скота, которому скармливают большие количества концентрированных кормов, но и излечивает животных, которые уже страдают от подобных зя— болеваний.