Способ исследования биологических объектов

 

Изобретение относится к способам исследования биологических объектов и может быть использовано для комплексного анализа фотосинтезирующих объектов. Целью изобретения является повьшение точности и информативности анализа. Цель достигается за счет построения термограмм флуоресценции . Для выявления преобладания в объекте фотосистемы I или фотосистемы II объект возбуждают в диапазоне длин волн 400-550 нм. Затем регистрируют зависимость интенсивности флуоресценции образца от температуры в диапазоне длин волн 650 - 770 нм. На термограммах получают - пики, соответствующие фотосистеме I и фотосистеме II. Расчитаны относительные содержания фотосистем. 6 ил. 2 табл. сл с IND со

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ÄÄSUÄÄ 1254369 А 1 (so a С 01 Ы 21/64

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ г

f л

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3898964/24-25 (22) 05.03.85 (46) 30.08.86. Бюл. В 32 (71) Ереванский. ордена Трудового

Красного Знамени государственный университет (72) Д.H. Джавршян (53) 535.5(088.8) (56) Рубин Б.А., Гавриленко В.Ф.

Биохимия и физиология фотосинтеза.

Изд-во Московского университета, 1977, с. 146"155, Владимиров Ю.А., Литвин Ф.Ф.

Практикум по общей биофизике. вып.

7Ш. Фотобиология и спектральные методы исследования. М., 1964, с. 109" 147.

Тарусов Б.Н., Веселовский В.А.

Сверхслабые свечения растений и их прикладное значение. Изд-во Московскога университета, 1978, с. 22-32. (54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ (57) Изобретение относится к способам исследования биологических объектов и может быть использовано для комплексного анализа фотосинтеэирующих объектов. Целью изобретения является повыщение точности и информативности анализа. Цель достигается за счет построения термограмм флуоресценции. Для выявления преобладания в объекте фотосистемы Т или фотосистемы II объект возбуждают в диапазоне длин волн 400-550 нм. Затем регистрируют зависимость интенсивности флуоресценции образца от температуры в диапазоне длин волн 650—

770 нм. На термограммах получают пики, соответствующие фотосистеме I и фотосистеме II Расчитаны относительные содержания фотосистем. 6 ил.

2 табл.

3 12543

Изобретение относится к способам для проведегпгя оптического анализа фатаспстем (ФС) фотосинтезирующих объектов и может быть использовано в области биологических научных исследований, а также в области сельского хозяйства.

Цель изобретения — сокращение трудоемкости, повышение точности и инфорггативностп.

Известно, чта в фатасинтеэирующих растительных клетках в красной области спектра ответственным за флуаресценциго является молекула хлорофила а фатосистемы ЕЕ. При этом квантовый выход флуаресцеггцгпг коррелирует с функциональной активностью фотасинтетическогo B иормальных условиях хларофил ФС-1 флуоресцирует незначительно, и использование флуоресценции в аналити- чес cHrc целях почти невозможно. При ,ипактивации последнего квантовый вы.:ход флуаресценции хлорофила увеличи-" вается. Эта Объясняется тем„ чта, B клетке возбужденная молекула хлорами»гл эффективна используег энергию па фотосинтез, а при инактивации — на флуоресценцию. При этом КВ31! ТоВ551 вы 3О ход флуаресценции хлорофилл а увеличивается не только у фотасистемы

ЕЕ, но и у фотосистемы I °

Разработан способ для получения дискретной информации от ФС-Е и .ФС-.ЕЕ.3

Благодаря селективной инактивации

ФС-I и ФС-II высокой культурой и одновременному возбуждению и регистрации иэ флуаресцепции, получены термограммьг флуоресценции. Расшифрованы ники, .соответствующие ФС-Е и ФС-II, Найдены способы проведения анализа с помощью этих пикОВ, B частности, для определения атносительнога содержания фотосистем, фуггкцианальнаЙ активности хлорапластов и определения генетической устойчивости растений к экстремлльным воздействиям.

На фиг. 1 и 2 показана устройство ддя реализации способа; на фпг. 3— .термограмма флуаресцепции листа Alchieilla grossheimii интенсивности све,чения; Ha фиг. 4 — кинетика затухания

1 паслеснсчепия листьев Alrhimilla gras—

sheimii нл фиг. 5 и 6 — термаграммы

> < °

55 флуаресггеггггггг> рлзличгпгх бполагиче.ских

Объектов, Способ реализуется устройством (фггг. 1), содержащим по ходу луча

60 2 источник света, линзы, светофильтры, гпторки> фОтаприемник и регистрирующее устройство, отличающееся тем,чта в него введены термоячейкл с датчиком температуры, скрещивающие светофильтры с возможностью возбуждать и выделять флуоресценцию обоих фотасистем, а также быстродействующий затвор с трехщелевой шторкой с возможностью их поочередного открывания и закрывания.

Устройство (фиг. 1) содержит три отсека (A, Б, В) в светонепроницаемую камер3 1, на основании которой собрана оптико-механическая часть устройства. Y. отсеку В снаружи вмонтирован осветитель 2 с лаггпай накаливания 3» конденсаторам 4, жидкостным (CUC1 )

5.1 и стеклянным 5.2 светофильтрами, а внутри этого отсека прикреплены линза 6 и призма 7, которые совместно с призмами 8 и 9 (отсек Б) формирует пучок возбуждающего света, затвор

10, датчик температурьг 11, фотоумножитель 12, светофильтр 13, В отсеке Б смонтирован также затвор 10 со щелевай шторкой 11 (фиг,1 и 2), состоящей из кожуха шторки 14 с двумя окошками для возбуждающего света 15 и регистрации люминесценции 16, Шторка 11 выполнена в виде пластинки с тремя щелями: одна общая 17 для регистрации послесвечения и флуоресценции, а две другие — для возбуждения флуаресценции 18 и паслесвечеьнгя 19.

Затвор снабжен также двумя пружинами

20 и 21, завадно-пусковым рычагом

22, приводящим затвор в действие, двумя защелками 23,1, 23.2 с пружинами 24,1, 24.2, фиксирующими положение шторки, и двумя пусковыми шнурами 25. 1, 25. 2.

В отсеке Б прикрепляется также съемная массивная термоячейка 26,выполненная из латуни с внутренним электрическим нагревателем обеспечиа вающим равномерный нагрев (3 С в.минуту), снабженная объектодержателем с датчиком температуры 11.

В отсеке А вмонтированы фотоумножитель (ФЭУ) 12 и светофильтр 13 для регистрации люминесценции. Питание ФЭУ осуществляется высоковольтным выпрямителем 27, для усиления сигнала ФЭУ использован усилитель пастояннога.така 28, а регистрация проводится на самописце 29 или на осциллографе 30. Для питания осветителя и термоячейки использован фер1254360 4 с- руют интенсиьность стационарной флуоресценции в зависимости от температуры в интервале 25 — 27 С. При этом образец нагревают с постоянной скоростью (примерно 3 град/мгпг), Флуоа ресценциго объекта возбуждают таким — образог., чтоГ. ФС-7. и ФС-II возбужда-. лись одновременно, что осуществляется с помощью светофильтра в диапазо10 не 400-550 нм, а интенсивность флуоресценции ФС-I и ФС-II регистрируют на 650 770 нм через красный свето2, фильтр.. Нами исследована зависимость флуоресценции от температуры около т 15 100 листьев растений рЬазо1цз vulgaris u Alchimilla grossheimii. т В табл. 1 представлены данные измерений по одному типичному листу.

ОСФ =

I ь5 рорезонансный стабилизатор и трап форматор Зl, 32, 33.

Устройство работает следующим об разом.

Для регистрации послесвечения включается электропитание устройств фиг. 1), затем интактлый фотосинте зирующий объект с держателем помеща ется в термоячейку 26, и щелевая шторка 10 приводится в рабочее поло жение. Для этого заводно-пусковым рычагом 22 шторка вытягивается,при этом натягиваются пружины 21,1, 22. и заведенная шторка удерживается за щелкой 23. При этом шторка закрывае окно !.6 фотоумножителя и открывает окно возбуждающего света 15. Свет о заранее включенного источника с помощью оптических систем — линзы 4, светофильтра 5.1. 5.2, линзы б,призм 20

7, 8,9, фокусируется на образец.

После 10-20 с освещепия образца нажимом на рычаг 22 освобождается шторка

10 от защелки 23 и под действием пружины 20, 21 шторка мгновенно 25 (0,005 с) закрывает окошко возбуждающего света 15 и одновременно открывает окошко фотоумножителя 16.При этом свет послесвечения фотосинтезирующего образца (точнее от фотосисте-30 мы Х?) переходит через светофильтр и попадает на фотоумножитель. Возникающий фототок усиливается с помощью усилителя постоянного тока, и на осциллографе или на самописце регистрируется кинетика затухания интенсивности свечения от времени.

Как видно из табл. 1, в области температуры 45-70 С интенсивность о флуоресцепцип резко возрастает и пио ки обнаруживаются при Т = 55 и Т =

65 С.

На фиг. 3 кривой 34 представлена термограмма флуоресценции листа

AIchimi1la grossheimii, произрастающего v вьгсокогорных условиях (3200 м от уровня моря), а кривой 35 — гермограмма растения, произроспгего В долинньи условиях (1100 м от уровня моря).

Относительное содержание фотосистем (ОСФ) определяется по отношению

ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ЗавиСИмостИ послесВЕчения от температуры вклгочением тер40 моячейки 26 образец нагревается до желаемой температуры, и затем регистрируется кинетика послесвечения.

Для регистрации флуоресценции и термоиндуцированного изменения флуоресценции образца достаточно во вто- 45 рой раз нажать на рычаг 22. При этом отодвигается защелка 23 и шторка 10 окончательно продвигается внутрь кожуха, свет источника 3 проходит от щели шторки 19 на образец для возбуждения флуоресценции. Одновременно включается самописец 29, термоячейка

26 с датчиком температуры 11, и запи сывается интенсивность флуоресценции

B зависимости от температуры.

Пример i. Для определения относительного содержания фотосистем фотосинтезирующего объекта регистриДля высокогорных растений отношение ФС-ХТ и ФС-Т составляет 1,04 1, а для растений долины — 0,947. Из приведенных соотношений видно, что у образца, произраставшего в условиях высокогорья, ФС-I меньше, чем ФС-II.

Относительная функциональная активность хлоропластов (Л) определяется по отношеншо

Л =

55 ;65

С падением величины отношения, начи.ная с единицы, функциональная активHOC 1 Ü ПОНЬШгаЕТСяе ДЛЯ ВЫСОКОГОРНЫХ образцов оно составляет 0,888, а для растении, произрастлгощих в услогиях долины, составляет 0,842. Таким образом, относительная функциональная активность хлоропластов в высокогорных условиях гораздо ниже.

S 12543

Пример 2, Для определения относительной функциональной активности ЭТЦ между фотосистемами регистрируют послесвечекие листьев н зависимости от температуры и по отноюению

А.,= I D!tl.,.максимумов судят об

53Ц 3а 45

a K T I I II ll D C T H °

На фиг. 4 представлена кинетика затухания послесвечения листьев

Л1сhimilla grossheiTilii, произраставших в условиях вь3сокогорья при комнатной температуре — кривая ЗЬ, при

40 С вЂ” кривая 37. К,ивой 38 и 39 соответственно представлены послесвечения у растений, произраставпьих в условиях долины, Односителъная функциональнал активность ЭТЦ между ФС у образцов высокогорных условий составляет 0,500, а н словиях долины

0,442, т.е. у растений, произрастанllllIx B условиях, активность значительно н33же, П р и и е р 3. С целью иллюстрации преимущества предлагаемого cnocoGa приведены результаты исследования по пзучению термоиндуцпрованного изменения выхода стационарной флуоресцснции при разных этапах формирования или при селекгивном разруп3епии фотосистем.

На фиг. 5 представлены термограммы флуоресценции нормальньг< (кривая

40) и этиолированных листьев ячменя.

{кривая 41), Как видно, на первом этапе формирования мембран преобладает С3С-1. При формировании фотосин35 тетическогo аппарата сначала формируется ФС-I а затем ФС-II, a у нормального листа ФС-11 преобладает над

ФС-I

На.фиг. б представлены термограммы флуоресценции нормального листа фасоли до (кривая 42) и после облучения (кривая 43) рубиновым лазером (3 = 6943 Л, 4 10 Бт/3<2). Под действием излучения рубинового лазера происходит в освовном селективная деструкция ФС-1, о чем свидетельствует исчезновение пика в области

65 С, 50

Пример 4. Разработанньгй способ исследования фотосинтезирую щих обьектов можно успеп3но применять для определения генетической устойчивости растений к экстремальным воз55 действиям окl i жаю3пей среды. Цчя определения устойчивости растений к действиям ор33цательной температуры опытный вариант растения подвергают дей60 6

< тнию отрицательной температуры (3 мин — 5 С) в холодильную камеру. о

Регистрируют зависимость интенсивности флуоресценции от температуры опытных и контрольных листьев, а генетическую устойчивость (ГУ) определякт по с!отношению

55а т5а где 1 и 1 о интенсивность флуорес55а 25 ценции опытного образца при 55 С и 25 С соответственно;

I u I — интенсивность флуорес55 >5 ценции контрольного образца при 55 С и 25 С.

В табл. 2 сопоставлени данные флуоресцентных показателей генетической устойчивости растений с известной устойчивостью к отрицательным температурам, Как видно из приведенных данных, высокогорные растения по сравнению с растениями, произрастающими н условиях долины, обладают более высокой устойчивостью к низким температурам, т.е. высокогорние растения более морозоустойчивы.

Таким образом, изобретение позволяет провести точный анализ фотосистем и их функционирования, значительно уменьшить трудоемкость работы и повысить информативность за счет проведения анализа на живых фотосинтезирующих объектах.

Формула изобретения

Способ исследования биологических объектов путем облучения объекта и измерения вторичного излучения, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повьппения точности и информативности за счет выявления преобладания в объекте фотосистемы 1 или фотосистемы 11 и для определения функциональной активности хлоропластов и генетической устойчивости растений, объект возбуждают излучением в диапазоне длин волн 400-500 нм и регистрируют зависимость интенсивности флуоресцен3 ии образца от температуры и диапазоне длин волн 650-770 нм, и селектируют фотосистемы по пикам при этом первый пик нри температуре 50—

60 С соответствует фотосистеме II, а

D второй пик при температуре 60-70 Сфотосистеме I, и определяют по фор7 1254360 мулам относительное содержание фотосистем (ОСФ):

Гу = " -1 - — 1OOZ

ОСФ = ", Тбе

1 1 1ТТТ

Температура, С 25 30 35 40 45 .$0 55 60 65 70

Интенсивность флуоресценции, Тоти ед

64 65 65 77 112 120 110 99 85

Phasolus vulgaris

Alchimilla grossheim11

113 114 115 116 120 130 121 136 117

Таблица 2

Вид растений

Генетическая моро" зоустойчиность (ГУ), 7

Бодяк (произраставщий на высоте .3500 м) Бодяк (произраставщий на высоте

1000 м) 95

Одуванчик высокогорный

Вероника высокогорная

70

Фасоль

Кукуруза

Т5

5 функциональную активность (A) хлоропластов:

A = Лл .

%5 вбей генетическую устойсивость (ГУ) расте- 1р ний где I>>., I >. — интенсивность флуор сценции исследуемого объекта при 55 С и

25"С соответственно;

I- ., I — интенсивность флуоресценции колтрольного объекта при 55 С и

25 С соответственно.

f00

РО

О

И

О

Р

om. Ы

1 254360 г

8m. 80

ma

И

Ю 30 И 50 О 70 Т С Раг. 5

20 N _#_ 50 й) 70 Т С

Риг. Ю

Редактор В. Ковтун

Тирах 778 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1 13035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Заказ 4713/47

Производственно-полиграфическое предприятие, г; Ухгород, ул. Проектная, 4

О

М

О

7g

О

su т0

Z0

Составитель Б. Широков

Техред А.Кравчук - Корректор С, аверин