Способ получения липоарабиноманнана,обладающего противоопухолевой активностью

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

COLg4AËÈÑTÈ×ЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (50 4 А 61 К 35/66

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К flATEHTY

b3

Ю

4ь

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2943651/28-14 (22) 03.07.80 (31) А-54-84681/79 (32) 04.07.79 (33) JP (46) 15.05.86. Бюл. У 18 (71) JP (72) Чиэато Маруяма (JP) (53) 576.8.097(088.8) (56) Заявка Японии 11 48-4384?, сер. 6(1), М- сб. 46(46), 1973.

„Л0„„12 2124 АЗ (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОАРАБИНОИАННАНА, ОБЛАДАКЗЦЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ, эаключакицийся в том, что биомассу Mycobacteruim

tuberculosis штамма Aoyama или Н,RV

Р

11 экстрагируют водой при 100 С с последующим выделением и очисткой целевого продукта.

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повыпения иммунологической активности- целевого продукта, последний этерифицируют жирной кислотой, например пальмитиновой.

35

1 12321

Изобретение относится к медицине и касается получения лекарственного препарата.

Целью изобретения является получение липоарабиноманнана, обладающего противоопухолевой активностью, а также повышение иммунологической активности целевого продукта.

Способ иллюстрируется следующими примерами. 10

Пример 1. Саутон среду засевают МусоЬасьег итп tuberculosis штаммом Aoyama и аэробное культивирование продолжается 14 дн. Клеточные тела отделяют фильтрацией и промывают холодной водой, после чего добавляют дистиллированную воду для флотирования (всплывания) клеток в воде. Клеточную взвесь нагревают при 100 С в течение 120 мин и фильтруют с получением водного раствора экстракта клеточных тел. К раствору добавляют сульфосалициловую кислоту для осаждения белкового компонента, после чего раствор подвергают цент- 25 рифугированию для его разделения.

Супернатант диализуют с использованием диализной мембраны, полученную жидкость смешивают с 9 частями по объему этилового алкоголя, получен- 50 ную смесь разделяют центрифугированием и затем отделяют осажденный сырой липополисахарид.

Сырой липополисахарид загружают в колонку, набитую ДЕЛЕ-Сефадексом

А-25 (бикарбонатная форма) и собирают фракцию, элюированную дистиллированной водой. Эту фракцию концентрируют, перемешивают с. равным количеством этилового алкоголя и смесь разделяют центрифугированием. Супернатант концентриру от и просеивают путем молекулярного просеивания согласно высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием колонки, набитой ТБК Се1 4000 SN> TSK Oål 3000

S41 и TSK Gel 2000 811, при этом собирают фракцию с молекулярным весом от 10000 до 160000. Эту фракцию диализуют, концентрируют и затем очищают аффинной хроматографией, с использованием конкавалин А-связанной агарозы с получением очищенного липаполисахарида. Липополисахарид состс,— ит из 617 арабинозы, 387. маниозы и

1% глюкозы, содержит жирные кислоты: метил лаурат, метил миристат, метид пальмитат, метил гентадеканоат, метил

24 . 2 стеарат, метил алеат, метил туберкулостеарат (всего 150, 7 мкг), Структура сахаридной цепи представлена в табл. 1.

Пример 2. Мусо асгегзцш

tuberculosis штамм Н, К,, культивируют и затем обрабатывают биомассу согласно примеру 1. После очистки получают липополисахарид, состоящий из 567. арабинозы и 447. маннозы; содержит жирные кислоты: метил лаурат, метил миристат, метил пальмитат, метил гептадеканоат, метил стеарат, метил туберкулостеарат (всего

79,6 мкг).

Структура сахаридной цепи представлена в табл. 2.

Пример 3. Способ получения липоарабиноманнана из безлипидного арабиноманнана.

Биомассу, полученную по примеру

1, экстрагируют щелочью 1 í. NaOH при комнатной температуре и путем молекулярного просеивания получают арабиноманнан с молекулярным весом от 8500 до 14000. Полученный арабино— маннан далее очищают афинной хроматографией, высушивают и 10 мг сухого арабиноманнана, вводят в реакцию с

10 мг пальмитинового ангидрида при

50 С в течение 20 ч в N N-диметилформамидпириридин. К реакционной смеси добавляют этиловый эфир и осадок отделяют центрифугированием, промывают этиловым эфиром, высушивают с получением 11 мг липоарабиноманнана.

Структура сахаридной цепи аналогична препарату по примеру 1. Пальмитиновая кислота связана в основном по 5 положению арабинозной единицы в цепи арабиноманнана в количестве

9,8 вес.7. и средний молекулярный вес — более 12500.

Пример 4. Биомассу, полученную по примеру 2, экстрагируют щелочью 1 н. Na0H при комнатной температуре, подвергают очистке арабиноманнан согласно примеру 3. 10 r cyхого арабиноманнана вводят в реакцию с 8 мл пальмитолхлорида при 37 С в течение 16 ч используя в качестве растворителя смесь пиридина с N,N-диметилформамидом. К реакционной смеси добавляют этанол и отделяют образующийся осадок центрифугированием, промывают его этиловым эфиром и сушат, получая в результате 10 мг липоарабиноманнана.

Обнаруженный сахарид Индикаторная связь Отнош метил (* 170

6,2

2,3-Ди"О-метил-D-арабиноза

41,0 5(Araf) 1

8,0

3,5-Дн-О-метил-D-арабиноза

59,5Х

2(Araf) l

7,2

1,0

5 1

2"О-Метил-D-арабнноза

2,3,4,6-Тетра-О-метилD-манноза

- (Мапр) 1

12,8

2ю5

3,4,Ь-Три-О-метил-D-маиноза

6,1.

2(Manp) l

1,2

1,4

7,2 40,5Х

14,4

2,8

3, 4-Ди-О"метил-0"манноза — (Мапр) 1

100

19,5

Общее

3 12

Структура сахаридной цепи вещества аналогична веществу, полученному по примеру 2. Пальмитиновая кислота связана в основном со звеном арабиноэы в цепи арабиноманнанан в положении 5 в количестве около 7,6 вес.Ж и средний молекулярный вес составляет 12000.

Пример 5. 5 мг арабиноманнана, содержание жирной кислоты в котором около 37 и который получен способом, аналогичным примеру 1, обрабатывают ультразвуком с 10 мг пальмитоилхлорида в пиридине и реакцию проводят при 37 С в течение

18 ч. К реакционной смеси добавляют этиловый спирт, осадок собирают,промывают этиловым эфиром и высушивают с получением 4,3 мг липоарабиноманнана.

Анализ показывает, что пальмитиновая кислота связана в основном по

5 положению арабиноэной единицы и 6 положению маннозной единицы в цепи арабиноманнана в количестве около

28 вес.Х и средний молекулярный вес около 14000.

Липоарабиноманн,, полученный по примерам 3 и 5,может быть получен также при использовании безлипидного или ниэколипидного арабиноманнана, экстрагированного и очищенного из клеточных тел Mycobacterium tubercu—

losis штамма Н Rv. Кроме того,вмесзг

2,3,5-Три-О-метил-D-арабиноза (Araf) l

2,3,4-Три-О-метил-D-манноза 6(Малр) 1

32124 4 то пальмитиновой кислоты по примерам

3 и 5 может быть использована стеариновая кислота, Следующие примеры иллюстрируют противоопухолевую активность арабиноманнана..

Пример 6. Клетки (1х10 ) опухоли Саркомы-180 подкожно трансплантируют dd. Y мышам (самки, возраст

10 10 нед.), которые были сенсибилизированы BCG. Начиная со следующего дня, липоарабиноманнан, растворенный стерильно в физиологическом растворе, вводят подкожно группам мышей (каждая

15 группа состоит из 8 мышей) в количестве от 0,2 до 2,0 мкг на каждую мышь через день 8 раз в целом. Через 30дн. после трансплантации опухолевых клеток тестируемых животных забивают и измеряют вес опухоли. Противоопухолевую активность каждого липоарабиноманнана оценивают на основе измерения веса опухоли. Раствор для инъекции готовят следующим образом.

25 1 мг липополисахарида растворягот в соответствующем количестве физиологического раствора для инъекций с образованием 100 мп раствора. Раствор готовят в виде формы для подкожных инъекций, содержащей 10 мкг/мп липополисахарида. Этот раствор вводят подкожно 1-3 раза (10-30 мкг липополисахарида) в неделю.

Побочных эффектов при использовании препарата не наблюдается.

35 Таблнца 1

1232124

Таблица 2

Индикаторная связь

Обнаруженный сахарид

2,3,5-Три-О-метил-D-арабиноза

3,0 — (Araf) 1 ——

0,9

41,5

12,4

55, 57.

?,7

2,3 3,3

2-О-Метил-D-анабиноза

1,0 (Araf) 1

2,3,4,6-Тетра-О-метилD-манноза

- — (Manp) 1

9,4

2,8

3,4,6-Три-О-метил-D-манноза

-2(Мапр) 1

9,0

2,7

17,7 44,5Х

5 3

8,4

2,5

100

29,9

Общее

Составитель Г. Смирнова

Техред В.Кадар Корректор С ° Черни

Редактор Ю. Середа

Заказ 2664/60 Тираж 660 Подписное

ВНИИПИ 1"осударственпого комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород,ул. Проектная, 4

2,3-Ди-метил-D-арабиноза + — 5(Araf) 1

3,5-Ди-метил-D-арабиноза - 2(Araf) 1

2,3,4-Три-О-метил-D-манноза 6(Hanp) 1

3,4-Ди-О-метил-D-манноза 2

6(Мапр) 1

От ноше ни е к 2-0- Содержание, 7. метил-арабинозе (=1,0)