Способ получения полисахаридов, обладающих противоопухолевым действием

 

о и иЫЬ»

ИЗОБРЕТЕ Н ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

< 704431 (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 08.04.77 (21) 2468116/28-13 (23) Приоритет — (32) 07.07.76 (51) M. Кл.

А 61 К 35/66

Гасударственный комитет

СССР по делам нзооретеннй и открытий (31) 80665/76 (33) Япония

Опубликовано 15.12.79. Бюллетень № 46

Дата опубликования описания 25.12.79 (53) УДК 612.396.. 11 (088.8) Иностранцы

Сабуро Уэно, Чика Есикуми, Фумио Хиросе, Есио Омура, Тосихико Вада, Такаеси Фудзии и Эйичи Такахаси (Япония) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

Куреха Кагаку Когио Кабусики Кайся (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Г1ОЛИСАХАРИДОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ ДЕЙСТВИЕМ

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается получения противоопухолевых препаратов.

Известен способ получения полисахаридов. обладающих противоопухолевым действием, путем экстракции грибов горячей водой с последующим выделением и очисткой целевого продукта (I). Однако при известном способе выход целевого продукта достигает 2,4%.

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта.

Эта цель достигается тем, что экстракции подвергают грибы

Coriolus егясо1ог (Гг.) (,)ие1, CorioIus hirsutus;(Fr.) QueI, Coriolus cousors (Вегк) 3maz,, Cori olus соисЫег (Schw.) Pa t., Coriolus puaescens (Fr.) puef,, Coriolus pargamenus (Fr.) Pa t., Coriolus ai formis (KIotz.) Pa t., а затем осуществляют повторное многократное экстрагирование водным раствором щелочи с постепенно возрастающей концентрацией, не превышающей 2N. Кроме того, повторное экстрагирование осуществляют 3 — 8 раз.

Грибы рода Coriolus хранятся в научноисследовательском институте ферментов в

Агенстве технических наук и технологии (Шибаши, Япония) .

Способ осуществляют следуюгцим обра5

Грибы рода:oriolus подвергают сначала экстрагированию водой или водным раствором, содержащим небольшое количество щелочи (разбавленный щелочной раствор), а затем последующему экстрагированию в несколько стадий с использованием водных растворов с постепенно возрастающей концентрацией щелочи, концентрация растворов должна быть не выше 2 н. Водные растворы, используемые для экстрагирования применяют в количестве OT 5 до 200 раз превышающие по весу исходный материал в каждой стадии экстрагирования. Экстрагированис проводят при 50 в 100 С в течение от 20 мин до 5 ч.

Число стадий экстрагирования от 2 до

10, предпочтительно 3 — 8. Общее время нагревания должно быть менее чем 20 ч (независимо от стадий экстрагирования).

704431

«я -. Сствс (целочи используют (H,ö oокиси натрия, ка шя, кальция или аммония.

Fo!.; экстрагирование проводить с ис;ь:О; я.-.".!е.-.! Высоко концентрированных

ВО. 1((ых !целоче1ых растворов с самоГО начала o(з предварительного !!роведения водного экстрягирования, Bflxoд экстракта очень Вы 0Y II3 1(ервой стадии экстрагирования, но резко падает ня второй и последующих стаfHЯХ

Полученный экстракт нейтрализуют обыч;!ым мето,oil с использованием разбавленной соляной кислоты, а зятем подвергают р=! фи и и ров и и к).

Могут бь;ть различные методы рафинироВания, таки как ультрафильтрация, реверс!! вный осмос, гельфильтрация, высаливанис, которые могут быть использованы по о;дельности H.,IH В комбинации друг с друГОМ .

Элемснтарный анализ полученного полис яхя рида показывает, что по((ися харид состоит из углерода, водорода, азота и кислоРОДЯ.

Молекулярный Вес полисахарида находится в пределах от 5000 до 300000, средний молекулярный вес находится В д(апязоне от 10000 до 100000.

Фракции с низким молекулярным весом (меньше 5000) обладают почти пулевым ин.-ибиторпым действием против саркомы-180 твердых опухолей на мышах при внутримышечном введении., a также они имеют горечь. неприятный запах и побочные действия.

ПолИсахариды, полученные предлагаемымым способом, оказывают противоопухолеВое действие на мышей не только при внутримышечном введении, но и при пероральном

ВВЕДЕНИИ. I 10. (ИСЯ ХЯРиды llf. ВЫЗыВЯЮт ИОООЧIlI-.Ix действий в химиотерапии рака и увеличивают чувствительность к радиотерапии, предотвращают инфекционные болезни, вызываемь(е Вирусами или бактериями, при перора IbHo!f введе;!и и улучшают жизненные функции, улучшая аппетит, работу кишечника.

Пример 1. 200 г сухой мицелы (содержание влаги 9,9%) кориолуса разноцветного (F!.) Que1. (FERM-Р 1х)0.2414), полученной из искусственной культуры, и 3 л воды помешают в сосуд емкостью 5 л, снабженный мешалкой. Смесь перемешивают на кипящей водной бане и выдерживают при этих условиях в интервале температур 95+-2 С в течение 3 ч. Затем смесь охлаждают и подвергают отсасывающей фильтрации путем использования воронки Бюхнера для разделения грибов и экстракт-раствора, зятем осажденный мицелий промывают 1 л воды и смешивают с экстракт-раствором. Смешанный раствор составляет около 3,5 л . pH экстракт-раствора 5,8. Оставшуюся мицелу затем снова смешивают с 2 л воды, затем подвергя!01 примерно,вух !Ясовой экстракции и промыванию 1 л воды до получения

3 л экстракт-раствора. Коне -:иь::й грибной

Оста!ток OHGH!I смеши f!3 IG " с 2 л О, i H. pdc . — вора гидроокиси натрия и подобных! же образом экстагируют и?H 95:2=f в течение

2 ч с последующим охлаждением, нейтрализацией 2 N соляной кислотой и отсасывающей фильтрацией для отделения экстракт-раствора и остатка грибов. После отделения остаток промывают-500см" Воды и смешивают с экстрак--раствором до получения 2,5 л раствора.

Подобные операции повторяют с использованием 2 л 0,2 и., 0.3 Ii. и 0,4 н. растворов гидроокиси натрия и 0,5 л f".poìllâfloé воды до получения 2,5 л экстракт-раствора пз каждого процесса.

Эти (несть порций экстракт-раствора (общее количество 16.5 л) сливают вместе и концентрируют Вакуумным концентратом (роторный испаритель) при 60 С дo

700 см и затем помещают В целлюлозную трубку .1ля диализа при действии тока диализа при 5 С В течение 72 ч, и полученный диализат затем концентрируют и подвергают сушке вымораживанием до получения 60 г коричнеBoIO порошка с содержанием влаги 7% (выход 31,1%). Элементарный анализ этого порошка дает 40,3О/р углерода, 6 2% водорода 2 9% азота и 50 6а/о кислорода. Молекулярный Вес этого Вещества, определенный на хроматогряфичсской колонке, приблизитсль!., 10000 -250000, а средний молекулярный вес, определенный с помощью метода ультрацептрифуГH с использоВанием Воды В кячес1 BE ряс l ВО(зителя,94000.

Опыты показали. что порошкообразное вещество — — это язотсодерж щий полисахарид. Ингибируюц(ее действ(!е Э.ГОГО вещес Вя против Саркомы-! 80 -: Вердых Опххо.!ей í- мышах было Вь(соких, равным 90 /> при внутримышечном введ иии 70" В !IpH введении пppoрял(,но.

Противоопухолевое действие этого Вещества определяют с помощью обы .ного метода.

Опухоли клети саркома-180 пересаживают в брюшнуfo полость мышей после интенсивного роста в течение 7 дней, 10 этих клеток пересаживают под кожу влагалища других мышей для образования твердых опухолей. При внутримышечном введении препарат дают в дозе 10 мг/кг один раз каждый день в течение 20 дней при общей дозе 0,2 мл на 20г (веса мыши),а при пероральном введении полисахарид дают в дозе 1,000 мг/кг один раз в день в течение

20 дней при общей дозе 0,2мл/20 г (веса тела мыши) . Опухоли образуют ядро на 25-й день после пересаживания, а задерживание роста опухоли в процентах подсчитывают

704431 как отношение среднего веса опухоли в мышах, которое дает полисахарид, и среднего веса опухоли в контрольных мышах.

Результаты - подобного рода опытов экстракции, проводимые с использованием только одной воды в качестве растворителя, показаны ниже в табл. 1. В этих опытах все стадии экстракции и промывания осуществляют путем использования воды в тех же количествах, в которых используют растворитель при упомянутой выше обработке.

В этом случае экстракт-раствор (смешанный с промывной водой) подвергают концентрированию с помощью вакуума, диализу, охлаждению и сушке, чтобы определить выход в каждой стадии экстрагирования. Эти результаты показаны в таблице. Из этой таблицы очевидно, что выход при экстрагировании резко падает во 2-й и последуюших стадиях экстраги рования.

Пример 2. Используя ту же самую аппаратуру, как и в примере 1,200 г сухой мицелы (содержание влаги 8,8%) кориолуса разноцветного (Fr.) fuel (FERM-Р NO. 2414) экстрагируют с помошью 2 л 0,05, 0,1, 0,2 и 0,4 н. растворов гидроокиси натрия. Температура экстрагирования 90 — 95 С и время экстрагирования составляет 2 ч в каждой стадии экстрагирования. После каждой стадии экстрагирования смесь охлаждают, нейтрализуют 2 N раствором соляной кислоты, а затем подвергают отсасываюшей фильтрации для разделения осадка грибов от экстракт-раствора. Осадок промывают

500 см воды после каждой стадии экстрагирования, и промывной раствор смешивают с соответствующим экстракт-раствором.

Экстракт-раствор на каждой стадии экстрагирования подвергают вакуумному концентрированию, диализу, концентрированию в сушке вымораживанием таким же образом, как это делают в примере 1, до получения коричневого порошка.

Результаты экспериментов по получению продукта в соответствующих стадиях экстрагирования показаны ниже в табл. 2.

Обший выход 27%, элементарный анализ каждого продукта, %, углерод 41,0; водород 6,3; азот 3,7; кислород 49,0.

Определено, что вышеупомянутый порошок в азотсодержашем полиеахариде имеет молекулярный вес от 10000 до 250000, а средний молекулярный вес 100000. Соотношение, оказывающее ингибиру юшее действие против Саркомы-180 твердой опухоли, на мышах 93% при внутримышечном введении и 73 /, при пероральном введении.

Для сравнения выхода при экстрагировании такие же эксперименты, как в примере 1, были проведены с использованием 1 н. и 0,4 н. растворов гидроокиси натрия с получением результатов, приведенных ниже в табл. 3. Как следует из таблицы, выход па10

13

21

3$

И дает, когда экстрагирование повторяют при использовании экстракт-раствора той же самой концентрации, и очень трудно получить высокий выход, такой же,как при многостадийном экстрагировании.

Памер 3. Используя аналогичную аппаратуру, как в примере 1, 200 r сухой мицелы (содержание влаги 9,9%) кориолуса разноцветного (Fr) Quel. (FERM-P NO. 2414) подвергают первичному экстрагированию Зл воды при 95 +- 2 С в течение 3 ч, а затем после охлаждения подвергают отсасываюшей фильтрации для разделения осадка мицелы и экстракт-раствора, осадок мицелы затем промывают водой в количестве 1 л и затем смешивают с экстракт-раствором с получением 3,5 л экстракт-раствора.

Затем к осадку добавляют 2 литра 1 н. раствора гидроокиси натрия для экстрагирования при 90 — 95 С в течение 0,5 ч, раствор затем охлаждают, нейтрализуют 2 N соляной кислотой, подвергают отсасываюшей фильтрации, промывают 1 л воды. В результате этих операций получают 3 л экстрактраствора и остаток грибов.

Все экстракт-растворы, полученные в результате проведенных операций, смешивают вместе и подвергают вакуумному концентрированию, диализу, дальнейшему концентрированию и сушке вымораживанием таким же образом, как в примере 1, в результате чего получают 33 г коричневого порошка с содержанием влаги 7% (выход

21,0 /О) . Результат элементарного анализа этого порошка показал, что порошок состоит из 41,7% углерода, 6,4% водорода, 3,9 /р азота и 48,00, g кислорода. Было обнаружено, что это вещество — азотсодержаший полисахарид с молекулярным весом от

10000 до 300000 и средним молекулярным весом 98000.

Ингибируюший эффект этого вешества против твердых опухолей саркома-180 на мышах оказался высоким и составляет 94% при вынутримышечном введении и 68% при пероральном введении.

Пример 4. Используя аппаратуру, такую же, как в примере 1, 200 r сухих плодовых тел Кориолуса разноцветного (Fr.) (,)ие1 (FERN-Р ХО. № 2414) с содержанием влаги 8,70/О первоначально подвергают экстрагированию с помощью 2,4 л воды при 95+:-2 С в течение 3 ч. Продукт после охлаждения подвергают отсасываюшей фильтрации для разделения осадка и экстракт-раствора, затем осадок промывают 500 см воды, и промывные воды смешивают с экстрактраствором, получив, таким образом, около

2,5 л экстракт-раствора.

Осадок затем смешивают с 2 л 0,4 н. раствора гидроокиси натрия и подвергают экстрагированию при 90 +-2 С в течение 1 ч, охлаждают, нейтрализуют 2 N раствором 04431

Та бл ица 1 о ст7,0

0,5

2,1

0,8

0,5

0 3

0,5

0,1

0,5

0,5

0,1

Общее количество

10,4

Количество мицел, используемое как исходный материал 200 г; температура екстрагирования 95 — 2 С, о

Примечание:

Та бл ица

ыход суого пороша, вес.%

0,05

9,0

10,1

3) 5

0,1

11,5

l2,5

13,0

0,2

0,4

6,6 со. !яппи кислоты, подвеp! d I;) г о i васы Багощей фильтрации и промывают 500 см воды, в результате чего получают 2,5 л экстракт-раствора и осадок. Подобную операцию экстрагирования повторяют с 2 л

1 н. раствора гидроокиси натрия при 80.+2 С в течение ч, в результате чего получают

2,5 л экстракт-раствора.

Все экстракт-растворы сливают вместе и подвергают концентрированию под вакуумом, диализу, концентрированию и сушке вымораживанием таким же образом, как в примере 1, при этом получают 43 4 г коричневого порошка с содержанием влаги 7,5% (выход 22%). Результат элементарного анализа этого порошка показал наличие 42,3 /„ òëåðoäà, 6,5% водорода, 2,2 азота и 49,0 /о кислорода. Порошок представляет собой азотсодержащий полисахарид с молекулярным весом 110000.

Ипгибрирующее действие этого вещества против твердь;х опухолей Саркома-180 на мышах высокое и равно 96 /о при внутримышечном введении .- 75% при пероральном введении.

Для сравнения величин выхода подобный процесс экстрагирования был проведен с использованием только одной воды в качестве растворителя. Выход порошка в этом случае был всего только 7,6 /о.

Предлагаемый способ обеспечивает высокий выход целевого продукта до 31,1 /,.

704431

Таблица Э

l0,5

13,8

2,4

2,9

2,0

0,5

1,5

Общий выход

14,5

20,2

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Редактор Л. Новожилова Техред М. Левицкая Корректор Н. Стец

Заказ 7828/48 Тираж 672 Подписное

ЦН И ИП И Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, )К вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал П П П к Патент>, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

1. Способ получения полисахаридов, обладающих противоопухолевым действием, путем экстракции грибов горячей водой с последующим выделением и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, экстракции подвергают грибы

Coriolus versicolor (Fr.) Quel, зе

Сопоlus hirsutus (Fr.) 1)цel, Coriolus cousors (Berk) Ymaz., Cori olus couch i f er (S chw. i P a t., Coriolus pubescens (Fr.) Яце1, Coriolus pargamenus (Fr.) Pat., Coriolus biformis (KLotz.) Pat., а затем осуществляют повторное многократное экстрагирование водным раствором щелочи с постепенно возрастающей концентрацией, не превышающей 2N.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что повторное экстрагирование осуществляют 3 — 8 раз.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Заявка Японии № 50-32304, кл. 30 А 32, опублик. 1975.